Page 207 - 《广西植物》2023年第2期

２ 期 杨钰洁等: 拟南芥 ｂＨＬＨ Ｉｂ 转录因子调控 ＦＩＴ 的转录 ４ ０ １

以外ꎬ与上面提及的＋Ｆｅ 培养基一样ꎮ 论文中所用 试剂盒在 Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ 仪
的 ＦＩＴ 过表达植物来自中国科学院遗传发育研究 器上进行定量检测ꎬ其中 ＡＣＴ２ 用作内参基因ꎮ

所凌宏清研究组(Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)ꎮ
１.２ 载体构建及转基因 ２ 结果与分析
提取 野 生 型 拟 南 芥 根 部 的 ＲＮＡꎬ 反 转 录 成
ｃＤＮＡꎬ通过 ＰＣＲ 获得了 ｂＨＬＨ３８ 的全长编码区序 ２.１ ｂＨＬＨ３８ 过表达促进了 ＦＩＴ 在加铁( ＋Ｆｅ) 条
列ꎬ并将其克隆到 ｐＯＣＡ３０ 双元表达载体上ꎮ 用载 件下的表达
体来转化农杆菌 ＥＨＡ１０５ꎬ并利用浸花法转化野生 选择 ｂＨＬＨ３８ 作为 ｂＨＬＨ Ｉｂ 转录因子的代表
型拟南芥ꎮ 将 Ｔ１ 代转基因种子置于 １ / ２ＭＳ ＋ ５０ 开展研究ꎮ ＩＲＴ１ 和 ＦＲＯ２ 是 ＦＩＴ 和 ｂＨＬＨ Ｉｂ 转录
￣１ 因子的靶基因ꎬ受到缺铁条件的诱导ꎮ 在我们的
ｍｇＬ 卡那霉素的平板上进行阳性苗筛选ꎮ
１.３ 定量 ＲＴ￣ＰＣＲ 分析 实验里ꎬＩＲＴ１ 和 ＦＲＯ２ 被用作阳性 Ｍａｒｋｅｒ 基因ꎮ
将在＋Ｆｅ(０.１ ｍｍｏｌＬ Ｆｅ( Ⅱ)￣ＥＤＴＡ) 垂直 我们用定量 ＲＴ￣ＰＣＲ 检测了缺铁响应基因 ＩＲＴ１、
￣１
板上生长 ７ ｄ 的幼苗ꎬ分别移到＋Ｆｅ 和－Ｆｅ 垂直板 ＦＲＯ２ 和 ＦＩＴ 的表达ꎮ 图 １ 结果表明ꎬ在＋Ｆｅ 情况
上生长 ３ ｄꎬ之后分离根用液氮冻存ꎮ 利用 Ｔｒｉｚｏｌ 下 ＩＲＴ１、ＦＲＯ２ 和 ＦＩＴ 在 ｂＨＬＨ３８ 过表达植物中的
试剂 盒 提 取 根 部 的 总 ＲＮＡꎬ 用 反 转 录 试 剂 盒 表达水平均显著高于它们在 ＷＴ 中的水平ꎻ而在
(ＴａＫａＲａ)的 ｏｌｉｇｏ( ｄＴ) 引物反转成 ｃＤＮＡꎮ 使用 －Ｆｅ情况下ꎬ它们在 ｂＨＬＨ３８ 过表达植物中的表达
１８
ＴＭ 则类似于或略低于其在 ＷＴ 中的水平ꎮ
ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ｋｉｔ( ＴａＫａＲａ) 定量 ＲＴ￣ＰＣＲ

ＷＴ. 野生型ꎻ ｂ３８ｏｅ￣２ 和 ｂ３８ｏｅ￣３ 表示两个独立的 ｂＨＬＨ３８ 过表达株系ꎮ 数据为 ３ 次生物学重复的平均值ꎻ 小写字母表示＋Ｆｅ 条件下差
异显著ꎬ大写字母表示－Ｆｅ 条件下差异显著(ＡＮＯＶＡꎬ Ｐ<０.０１)ꎮ 下同ꎮ
ＷＴ. Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅꎻ ｂ３８ｏｅ￣２ ａｎｄ ｂ３８ｏｅ￣３ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｗｏ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂＨＬＨ３８ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｉｎｅｓ. Ｄａｔａ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｘ±ｓ (ｎ＝３)ꎻ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ (ｕｐｐｅｒｃａｓｅ
ｌｅｔｔｅｒｓ ｆｏｒ －Ｆｅꎬ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｆｏｒ ＋Ｆｅ) ａｂｏｖｅ ｅａｃｈ ｂａｒ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ (ＡＮＯＶＡꎬ Ｐ<０.０１). Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ.
图 １ ＩＲＴ１、ＦＲＯ２ 和 ＦＩＴ 在 ｂＨＬＨ３８ 过表达植物中的表达情况
Ｆｉｇ. １ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＲＴ１ꎬ ＦＲＯ２ ａｎｄ ＦＩＴ ｉｎ ｔｈｅ ｂＨＬＨ３８ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｎｔｓ

２. ２ 四 突 变 体 植 物 的 ＦＩＴ 转 录 水 平 不 受 缺 铁 ＲＴ￣ＰＣＲ 检测 ＩＲＴ１、ＦＲＯ２ 和内源 ＦＩＴ 的表达( 图
( －Ｆｅ)诱导 ３)ꎮ 我们用跨 ＦＩＴ 基因最后一个外显子与 ３’ ＵＴＲ
对 ｂＨＬＨ Ｉｂ 的四突变体 ｂｈｌｈ４ｘ￣１ 和 ｂｈｌｈ４ｘ￣２ 的一个片段来定量内源 ＦＩＴ 的表达ꎮ 图 ３ 结果表
进行缺铁处理(Ｃａｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２１)ꎬ并通过定量 ＲＴ￣ 明ꎬ无 论 是 在 ＋ Ｆｅ 还 是 － Ｆｅ 的 情 况 下ꎬ ＩＲＴ１ 和
ＰＣＲ 检测 ＩＲＴ１、ＦＲＯ２ 和 ＦＩＴ 的表达ꎮ 图 ２ 结果表 ＦＲＯ２ 的表达水平在 ＦＩＴ 过表达植物中均轻微上
明ꎬ在 ＋ Ｆｅ 情 况 下ꎬ ＩＲＴ１ 和 ＦＲＯ２ 在 ｂｈｌｈ４ｘ￣１ 和 调ꎬ而内源 ＦＩＴ 的表达水平在 ＦＩＴ 过表达植物和
ｂｈｌｈ４ｘ￣２ 中的表达水平均显著低于它们在 ＷＴ 中 ＷＴ 植物中则均无显著差异ꎮ
的水平ꎬ而 ＦＩＴ 的表达水平则无明显变化ꎮ 相比 ２.４ 在＋Ｆｅ 条件下 ｂＨＬＨ３８ 和 ＦＩＴ 的双过表达促
较而 言ꎬ 在 － Ｆｅ 情 况 下ꎬ ＩＲＴ１、 ＦＲＯ２ 和 ＦＩＴ 在 进了内源 ＦＩＴ 的增加
ｂｈｌｈ４ｘ￣１ 和 ｂｈｌｈ４ｘ￣２ 中的表达水平均显著低于它 先分别对 ｂＨＬＨ３８ 和 ＦＩＴ 的双过表达植物进
们在 ＷＴ 中的水平ꎮ 行缺 铁 处 理ꎬ 再 通 过 定 量 ＲＴ￣ＰＣＲ 检 测 ＩＲＴ１、
２.３ 外源 ＦＩＴ 过表达不能激活内源 ＦＩＴ 的转录 ＦＲＯ２ 以 及 内 源 ＦＩＴ 的 转 录 变 化ꎮ 图 ４ 结 果 表
对 ＦＩＴ 过表达植物进行缺铁处理并利用定量 明ꎬ在 ＋ Ｆｅ 和 － Ｆｅ 的 情 况 下ꎬ 双 过 表 达 植 物 中