山茶属（Camellia L.）瘤果茶组（sect. Tuberculata Chang）因“子房与果实表面具瘤状突起”这一独特形态特征而有别于其他组植物，是以贵州为分布中心向周边省份扩散分布的类群（张宏达和任善湘，1991；闵天禄和钟业聪，1993；张宏达，1998）。1939年钱崇澎教授在四川省发现1个子房和果皮具有瘤状突起的特异种，命名为瘤果茶（Camellia tuberculata S. S. Chien）；Sealy（1958）将它归入半宿萼茶组（sect. Pseudocamellia Sealy Rev.）。张宏达（1981）依据“蒴果果皮有瘤状皱褶”这一独特的形态建立了瘤果茶组，起初仅有6种，此后10年间又相继报道了11种（张宏达，1991）。闵天禄和钟业聪（1993）通过对标本的观测，将17个种归并为6种和6变种；张宏达（1996）基于宏观形态研究，重新确认了15个独立的种。但是，由于瘤果茶组植物多生长在喀斯特山地，为狭域分布种，因此野外调查较为困难。前人对该类群的分类处理都是基于馆藏的标本进行宏观性状研究，缺乏多学科的分类学证据，一些分类学基本问题仍被遗留下来（如种间界限不明、名实存疑和亲缘关系不清等）。因此，补充该类群多学科数据有助于解决这些分类学问题。叶表皮微形态作为植物分类研究的证据之一（张浩和庄雪影，2004；敖成齐等，2022），已广泛应用在山茶属植物的分类学研究中。例如，李凤英等（2013）对金花茶系（ser. Chrysanthae Chang）25个分类群进行叶表皮研究，结果表明该性状在解决种间分类问题上有一定的分类价值。Lu等（2008）对瘤果茶组18种植物进行叶片解剖学、微形态和傅立叶红外光谱（FTIR）研究分析，并建议恢复11个种的种级分类地位。虽然该研究对该组植物做了较为详细研究，但所采集植物为同质园种植，缺少野外植株的多样性和代表性。因此，有必要继续对野外居群进行叶表皮研究。花粉形态也是分类研究中的重要证据之一（陈相洁等，2022；梁晓丽等，2022）。李广清等（2005）通过对连蕊茶组（sect. Theopsis Coh. St.）的6种植物进行花粉形态研究，结果表明6种连蕊茶组植物的花粉形态种间差异显著，可作为种间界定证据之一。

本研究首次报道了瘤果茶组10种植物的花粉形态数据，并对10种植物进行叶表皮微形态研究。以期补充该组植物分类学研究中的微形态数据，为进一步厘清瘤果茶组植物的种间界定和系统学研究提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

10 种植物材料均采自野外自然生长植株，凭证标本现存于贵州大学林学院标本馆（GZAC），采集信息和标本凭证见表1。

1.2 花粉扫描电镜方法

在野外采集时，将新鲜花药置于戊二醛中保存，带至实验室进行电镜扫描。具体步骤如下：将花粉在室温下自然干燥36 h；检测时，将花粉均匀地撒到粘有导电胶的样品台上，并用离子溅射仪镀金膜（厚8 nm），移入扫描电子显微镜下扫描。随机选取完整花粉进行观察、拍照。使用Image J图像软件测量极轴长（polar axis length，P）及赤道轴长（equatorial axis length，E）等指标。用Excel 2019统计数据，计算花粉极赤比（P/E）。花粉形态相关术语及分级标准参照韦仲新（1992）和王伏雄等（1995），根据极赤比将花粉的形状分为5级，即超长球形（P/E≥2）、长球形（1.5＜P/E＜2）、近球形（1＜P/E≤1.5）、扁球形（0.5＜P/E≤1）、超扁球形（P/E≤0.5）。

1.3 叶表皮制片方法

在干燥标本上取完整叶片（标本凭证见表1），沿叶脉裁剪成约1 cm × 1 cm的正方形，置于75%的NaClO溶液中常温漂白6~10 h（时间长短因叶质地差异而不同）。待叶肉组织和叶表皮细胞分离后，用镊子在载玻片上撕取上、下表皮，制成临时玻片，用光学显微镜（Olympus BX41）进行观察和拍照。形态术语参照王宇飞和陶君容（1991）的命名标准描述。

1.4 数据分析

在Image J软件和Excel 2019中进行花粉和叶表皮微形态数据的测量和统计分析，使用SPSS 22.0软件进行聚类分析。叶表皮气孔指数（stomatal index，I）和气孔密度（stomatal density，D）的计算公式如下：

I=N/ (N+E) ×100%；

D=N/S。

式中： I为气孔指数； N为固定面积内气孔数目；E为相同面积内表皮细胞数目；D为气孔密度； S为固定面积大小。

2 结果与分析

2.1 花粉粒大小及形状特征

瘤果茶组的10种植物均为单花粉粒，萌发沟类型为三孔沟并呈辐射对称状（图1，图2），极轴长在30.86~39.37 μm之间；赤道轴长在32.10~37.40 μm之间。极赤比为0.85~1.16。根据花粉形态分类标准，除皱叶瘤果茶为扁球形（图2：J2）和尖苞瘤果茶为长球形（图2：I2）外，其余8个种植物花粉均为近球形（图1：A2-E2；图2：F2-H2；表2）；黎平瘤果茶和厚壳红瘤果茶的极面观为三裂近三角形，其余8种植物的极面观为三裂近圆形；花粉赤道面观有2种（椭圆形与梭形），其中黎平瘤果茶和狭叶瘤果茶为梭形（图1：E2；图2：H2），其余8种皆为椭圆形；10种植物的外壁纹饰特征主要呈现出颗粒状、皱沟状或皱波状至颗粒状等形态，其中安龙瘤果茶、乐业瘤果茶和尖苞瘤果茶的外壁纹饰为皱波状至颗粒状（图1：A4、D4；图2：I4）；曾氏瘤果茶、黎平瘤果茶、狭叶瘤果茶和皱叶瘤果茶4个种植物的外壁纹饰为颗粒状（图1：B4、E4；图2：H4、J4），其余厚壳红瘤果茶、荔波红瘤果茶和三江瘤果茶3种植物分外壁纹饰为皱沟状纹饰（图1：C4；图2：F4、G4）。但10个种的种间外壁纹饰差异显著，网眼大小不一，形态也各不相同，这表明花粉外壁纹饰可作为瘤果茶组植物主要种间分类性状之一，有着重要的分类价值。

2.2 孢粉学的聚类分析

根据花粉的外壁纹饰、赤道面观、花粉形状、大小等14个结构指标对10个种植物进行R型聚类分析。由图3可知，在欧氏距离为4.5时，10个植物被分为6类，如黎平瘤果茶与狭叶瘤果茶最为接近，这2种植物花粉的外壁纹饰都具有颗粒状和花粉赤道面观为梭形的特点。这2种植物与乐业瘤果茶和曾氏瘤果茶共同组成一分支。厚壳红瘤果茶与尖苞瘤果茶组成另一类。当欧氏距离为15时，瘤果茶组10种植物分为2个类群：Ⅰ类由黎平瘤果茶、狭叶瘤果茶、乐业瘤果茶、曾氏瘤果茶、厚壳红瘤果茶、尖苞瘤果茶、荔波红瘤果茶和皱叶瘤果茶8个物种组成，这些种拥有更短的赤道轴和萌发沟较长等特点； Ⅱ类由安龙瘤果茶和三江瘤果茶2个物种组成，2种植物的花粉形态差异较小。

2.3 叶表皮形态特征

2.3.1 表皮细胞的形态

根据观察，10种植物的叶表皮细胞形态呈现出多样化，大致可分为5类（表3）。（1）无规则波形：表皮细胞为无规则形，大小不等，垂周壁样式为波状，如狭叶瘤果茶和皱叶瘤果茶的上表皮细胞（图4：I1、J1）；曾氏瘤果茶、厚壳红瘤果茶、荔波红瘤果茶和狭叶瘤果茶的下表皮细胞（图4：B2、C2、G2、I2）。（2）无规则浅波形：表皮细胞为无规则形，大小不等，垂周壁样式为浅状，如安龙瘤果茶、尖苞瘤果茶和乐业瘤果茶的下表皮细胞（图4：A2、D2、E2）。（3）无规则深波形：表皮细胞无规则形，大小不等，深波状垂周壁，显著加厚，在厚壳红瘤果茶上表皮和三江瘤果茶上下表皮细胞（图4：C1、H1、H2）与皱叶瘤果茶下表皮（图4：J2）中发现。（4）无规则直曲形：表皮细胞无规则，但垂周壁样式为直曲形，较为规整，仅在安龙瘤果茶、乐业瘤果茶和黎平瘤果茶的上表皮（图4：A1、E1、F1）中发现。（5）多边形：垂周壁样式包括直曲形、浅波状和深波状各1种，依次为黎平瘤果茶上表皮（图4：F1）、荔波红瘤果茶上表皮（图4：G1）和三江瘤果茶下表皮（图4：H2）。

2.3.2 细胞大小及腺体

通过Image J软件对叶表皮细胞进行面积测量，每种植物测30个细胞，取平均值。由表3可知，在上表皮细胞中，细胞截面积最小的是厚壳红瘤果茶（490.90 μm²），最大的是乐业瘤果茶（1 036.77 μm²），其中安龙瘤果茶（827.95 μm²）与曾氏瘤果茶（844.11 μm²）最为接近；细胞长/宽（length/width，L/W）最大值为1.38（安龙瘤果茶、曾氏瘤果茶和乐业瘤果茶），最小值为1.11（黎平瘤果茶）。对下表皮细胞进行分析，细胞截面积最小的是厚壳红瘤果茶（660.43 μm²），最大的是皱叶瘤果茶（1 396.60 μm²），黎平瘤果茶（900.41 μm²）与狭叶瘤果茶（897.10 μm²）细胞大小最为接近；细胞长/宽（L/W）最大为1.79（安龙瘤果茶），最小为1.19（荔波红瘤果茶），其中乐业瘤果茶和狭叶瘤果茶的下表皮细胞长/宽（L/W）都是1.26。在实验中发现有3种植物（曾氏瘤果茶、荔波红瘤果茶和皱叶瘤果茶）的表皮中有不同数量的腺体，其中曾氏瘤果茶的下表皮有着较多的油腺，上表皮也有少量腺体，皱叶瘤果茶的上表皮有着少量的腺体，荔波红瘤果茶的上、下表皮均存在较多的腺体。

2.4 气孔器

瘤果茶组10种植物的气孔器仅分布在下表皮，全部为环列型（图4），其垂周壁有直曲形、浅波状、波状和深波状等。由表4可知，气孔密度在6.67~14.67 ind.·mm^-2之间；气孔指数变化幅度并不显著，在10.50%~19.40%之间，其中最大的是乐业瘤果茶，为19.40%，最小的是三江瘤果茶，为10.50%。副保卫细胞有4~7个不等，多数为5~7个。

2.5 叶表皮的聚类分析

通过对叶表皮的气孔密度、气孔指数、细胞形状、垂周壁样式等8个结构指标进行R型聚类分析，由图5可知，在欧氏距离为3时，10个植物分为6个类群。其中，乐业瘤果茶与三江瘤果茶为一分支，这2种植物在叶表皮细胞的上表皮细胞形态和细胞截面积都较为相似，安龙瘤果茶、荔波红瘤果茶、尖苞瘤果茶和黎平瘤果茶为一分支，表明其亲缘关系较近；其余4个种各成一分支。当欧式距离为10时，10个种分为3个类群。其中，安龙瘤果茶、荔波红瘤果茶、尖苞瘤果茶、黎平瘤果茶、狭叶瘤果茶、曾氏瘤果茶、乐业瘤果茶、三江瘤果茶这8个种因更高的长宽比（L/W）和相近的气孔密度等特点聚为一类；而厚壳红瘤果茶因其有叶表皮细胞面积小且气孔密度低特点单独为一类；皱叶瘤果茶因下表皮细胞面积大和油腺点仅在上表皮特征为一类。

3 讨论与结论

瘤果茶组植物是山茶属在喀斯特石灰岩区域的特化类群，以贵州省为分布中心，扩散至西南及相邻中部省份，呈零星分布状，为限制性狭生态幅物种，种群极小，野外调查较为困难。前人对该类群的分类处理主要是基于馆藏标本对宏观性状的研究，一些种的种间界定仍模糊不清，分类困难。因此，增加花粉形态和叶表皮微形态作为分类依据有助于厘清瘤果茶组的种间界限和系统发育关系。

3.1 花粉形态在瘤果茶组中的分类意义

本研究首次报道瘤果茶组10种植物的花粉形态，补充了该类群植物花粉形态数据的缺失。结果发现10种植物均为单花粉粒，花粉形状都较为相似，以近球形为主，极轴长与赤道轴长之比在0.85~1.16之间，均较小。极面观有三裂近圆形和三裂近三角形2种类型；萌发沟类型为三孔沟。外壁纹饰有皱波状或颗粒状，各种植物间的颗粒大小差异较为显著，如曾氏瘤果茶、黎平瘤果茶和皱叶瘤果茶的外壁纹饰都为颗粒状，但其穿孔的大小和密度却不一样，这说明该组植物的外壁纹饰的差异具有一定的分类学价值，可作为种间分类依据。这与李广清（2005）对连蕊茶组6种植物花粉形态进行研究的发现是一致的，即外壁纹饰在种间差异性大，有分类价值。三江瘤果茶和安龙瘤果茶都分布在贵州省黔西南州，闵天禄和钟业聪（1993）依据2种植物的花白色和果实有毛，花柱3~5条的形态特征，将其归并为安龙瘤果茶，在聚类分析中发现在欧式距离为15时，2种植物在同一分支上，支持他们进行合并；黎平瘤果茶和曾氏瘤果茶都采自黎平县五龙山，闵天禄和钟业聪（1993）根据2种植物的狭披针形和相似的花性状将其归并为皱果茶。在花粉形态研究中，黎平瘤果茶的赤道面观为梭形，极面观为三裂近三角形，曾氏瘤果茶的赤道面观为椭圆形，极面观为三裂近圆形，聚类分析距离较远。因此，二者是否做合并处理还需进行宏观形态和分子生物学方面的研究才能下定论。

3.2 叶表皮微形态在瘤果茶组中的分类意义

瘤果茶组植物叶表皮细胞形状可分为无规则形和多边形2种类型，其中多边形在黎平瘤果茶和荔波红瘤果茶中发现，其余为无规则形，这表明细胞形状在一些种间有一定的分类价值。下表皮气孔均为环列状，这与Lu等（2008）对瘤果茶组植物的叶表皮形态研究结果较为相似，这表明这一性状对瘤果茶组植物的种间分类价值不高。但垂周壁样式有浅波状、波状、直曲形和深波状4种类型，相对于其他性状，有较高的分类价值。下表皮的形态结构在一些种间有着明显差异，可为一些种的分类提供一定的依据。由本研究结果可知，皱叶瘤果茶的细胞截面积最大（1 396.6 μm²），上表皮有少量的油腺，垂周壁样式为波状，下表皮气孔密度为9.33 ind.·mm^-2，副保卫细胞5~7个；厚壳红瘤果茶的下表皮细胞截面积最小（600.43 μm²），上下表皮细胞都无油腺，垂周壁样式为深波状，气孔密度为6.67 ind.·mm^-2，副保卫细胞4~7个。此外，叶表皮微形态其他性状特征（气孔密度、是否有腺体、气孔器等）在种间都存在明显的差异，可为瘤果茶组大多数物种种间划分提供一定的参考依据，具有一定的分类意义。

通过叶表皮微形态和聚类分析，结果表明乐业瘤果茶与三江瘤果茶的叶表皮微形态上有着较高的相似性，说明二者关系较近，结合二者都仅分布在北盘江流域一带，宏观形态相似（花白色，花柱3~5枚，蒴果瘤状，种子被毛），结果支持闵天禄先生将二者进行合并的分类处理。但是，仅依靠叶表皮微形态性状进行分类处理过于武断，应开展全面细致的分类研究才能下定论。

综上所述，供试的瘤果茶组10种植物的花粉形态和叶表皮微形态在种间都有一定的差异性，在一定程度表明这些性状对瘤果茶组的分类有一定的参考价值，可以作为种间鉴定的依据之一，能在一定程度上弥补依靠宏观性状难以解决的分类问题。然而，在野外调查中，我们发现瘤果茶组植物的种间分类问题较为复杂，种间杂交现象频繁发生。因此，应以居群为单位进行野外调查，并且采用多学科方法进行研究以解决该类群存在的分类学问题。

参考文献