Page 57 - 《广西植物》2020年第2期
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１ ９ ４ 广 西 植 物 ４０ 卷
成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成ꎮ ＰＣＲ 上游引物为 ＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡＣＡＣＴＧＧＴꎬ下
１.２ 试验方法 游 引 物 为 ＴＣＣＴＧＡＡＧＧＧＡＡＣＣＣＧＡＡＧꎮ ＥＦ１α 内
１.２.１ 总 ＲＮＡ 的提取和 ｃＤＮＡ 第一链的合成 采 参基因 上 游 引 物 为 ＧＣＣＧＴＣＣＴＴＡＴＴＡＴＴＧＡＴＴＣＣＡꎬ
用 ＯＭＥＧＡ ＨＰ Ｐｌａｎｔ ＲＮＡ Ｋｉｔ 植物总 ＲＮＡ 提取试 下 游 引 物 为 ＧＧＧＡＴＣＴＴＡＴＣＡＧＧＡＴＴＧＴＡＡＣＣＡꎮ
剂盒ꎬ按照其说明要求进行 ＲＮＡ 提取ꎮ 利用反转 反应体系共 ２０.０ μＬ:２ ×ＳＹＢＲ ® ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ Ⅱ
录酶 Ｍ￣ＭＬＶ 将白及总 ＲＮＡ 反转录成 ｃＤＮＡ 第一 １０.０ μＬꎬ１０ μｍｏｌＬ 上、下游引物各 ０.８ μＬꎬＤＮＡ
￣１
条链ꎬ作为白及 ＳｕＳｙ 基因克隆的模板ꎮ 模板 ２ μＬꎬ灭菌蒸馏水 ６.４ μＬꎮ 扩增程序:９５ ℃
１.２.２ 设计简并引物 根据 ＮＣＢＩ 中已经登录的单 预变性 ３０ ｓꎬ９５ ℃ 变性 １５ ｓꎬ５８ ℃ 退火 １５ ｓꎬ共 ４１
子叶植物 ＳｕＳｙ 基因ꎬ经 ＤＮＡＭＡＮ 序列比对ꎬ找出其 个循环ꎮ ｑＲＴ￣ＰＣＲ 结果按照公式 Ｒｅｌ. Ｅｘｐ ＝ ２ ￣ΔΔＣｔ
中保守的核苷酸序列ꎬ在 ＳｕＳｙ 基因的保守区设计一 计算该基因的相对表达量ꎮ 式中:ΔＣｔ ＝ Ｃｔ(ＳｕＳｙ) －
对简并引物ꎬ上游引物为 ＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡＣＡＣＴ￣ Ｃｔ(ＥＦ１ａ ＲＮＡ)ꎻΔΔ Ｃｔ ＝ (各植物组织 ΔＣｔ) －(一年
ＧＧＴꎬ下游引物为 ＴＣＣＴＧＡＡＧＧＧＡＡＣＣＣＧＡＡＧꎬ用于 生块茎 ΔＣｔ)ꎮ 数据差异性采用 ＳＰＳＳ １７. ０ ( ＳＰＳＳ
扩增目的基因ꎮ Ｉｎｃ.ꎬ Ｃｈｉｃａｇｏꎬ ＵＳＡ)软件进行单因素方差分析ꎮ
１.２.３ ＰＣＲ 扩增 ＳｕＳｙ 基因保守区 以逆转录获得
２ 结果与分析
的 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ利用上游引物和下游引物 ＰＣＲ
扩增白及的 ＳｕＳｙ 基因保守片段ꎮ 反应体系 １０ ×
￣１ ２.１ 白及 ＲＮＡ 提取
ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２.０ μＬꎬｄＮＴＰ (２.５ μｍｏｌＬ ) １.６ μＬꎬ
￣１
ＭｇＣｌ ( ２５ μｍｏｌ Ｌ ) １. ５ μＬꎬ 上、 下 游 引 物 ( １０ 由电泳结果可知ꎬ白及叶片总 ＲＮＡ 有完整的
２
￣１ ２８Ｓ、１８Ｓ 和 ５Ｓ 条带(图 １)ꎬ表明提取的总 ＲＮＡ 完
μｍｏｌＬ ) 各 １. ０ μＬꎬ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 ( ５ Ｕ
￣１ 整性较好ꎬ很少出现降解现象ꎬＯＤ２６０ / ２８０ 的值为
μＬ )０.２ μＬꎬ模板 ｃＤＮＡ １.０ μＬꎬ定量补足 ｄｄＨ Ｏ
２
￣１
至 ２０ μＬꎮ ＰＣＲ 反应条件:９４ ℃ 预变性 ３ ｍｉｎꎬ９４ ２.１２ꎬ浓度为 １１０.２３ ｎｇμＬ ꎮ
℃ 变性 ３０ ｓꎬ５８.５ ℃ 退火 ３０ ｓꎬ７２ ℃ 延伸 ３ ｍｉｎꎬ３０
个循环ꎬ７２ ℃ 延伸 ５ ｍｉｎꎮ
１.２.４ 白及 ＳｕＳｙ 基因保守区的鉴定 取 ＰＣＲ 产物
进行经琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ待检测之后ꎬ将扩增
产物进行 Ｔ￣Ａ 连接ꎬ转入大肠杆菌 ＤＨ５α 菌株进
行测序分析ꎮ 将测序结果进行 Ｂｌａｓｔ 比对分析ꎬ验
证测序结果的正确性ꎮ.
１.３ ＳｕＳｙ 基因的生物信息学分析
基因相似性采用 ＮＣＢＩ 上的 ＢＬＡＳＴ 分析ꎬ氨基
酸序列比对采用 ＤＮＡＭＡＮ 分析ꎬ蛋白质亲疏水性
采用 ＰｒｏｔＳｃａｌｅ 分析ꎬ亚细胞定位采用 ＰＳＯＲＴ Ⅱ软
件分析ꎬ蛋白质二级结构预测采用 ＥｘＰＡＳｙ 网站上 图 １ 白及总 ＲＮＡ 电泳图
的 ＧＯＲ 分析ꎬ系统进化树采用 ＭＥＧＡ６.０ 分析ꎬ蛋 Ｆｉｇ. １ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｂｌｅｔｉｌｌａ ｓｔｒｉａｔａ
白质三级结构预测采用 ＥｘＰＡＳｙ 网站上的 ＳＷＩＳＳ￣
ＭＯＤＥＬ 分析ꎮ ２.２ ＳｕＳｙ 基因的克隆
１.４ ＳｕＳｙ 基因的表达分析 以白及叶片总 ＲＮＡ 反转录 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ以
根据 ＳｕＳｙ 基 因 序 列 设 计 出 特 异 性 较 强 的 简并引物对保守区片段进行 ＲＴ￣ＰＣＲ 扩增ꎬ得到 １
® 个 ２ ２１５ ｂｐ 保守片段ꎬ编码 ７３７ 个氨基酸ꎬ连接到
ｑＲＴ￣ＰＣＲ 引物ꎬ参照 ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ Ⅱ
使 用 说 明ꎬ 用 ｑＲＴ￣ＰＣＲ ( Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐＧＥＭ￣Ｔ Ｅａｓｙ 载体上测序验证ꎬ得到的阳性质粒命
ＰＣＲ)的方法检测 ＳｕＳｙ 基因在白及不同生长阶段 名为 ｐＧＥＭ￣ＳｕＳｙ(图 ２)ꎮ
不同组织的表达量ꎬ白及 ＥＦ１α 基因作为内参基因 ２.３ ＳｕＳｙ 蛋白亲疏水性分析
(ＧｅｎＢａｎｋ 登 录 号: ＭＫ４４８２９３)ꎮ ＳｕＳｙ 基 因 ｑＲＴ￣ 利用 ＰｒｏｔＳｃａｌｅ 在线分析软件分析显示ꎬＳｕＳｙ
