Page 102 - 《广西植物》2020年第6期

８ ４ ８ 广 西 植 物 ４０ 卷
在线软件进行分析ꎮ 此外ꎬ核苷酸与氨基端序列
的同源 性 用 ＤＮＡＭＡＮ 软 件 进 行 比 对 分 析ꎬ 并 用 ２ 结果与分析
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ 和 ＭＥＧＡ 构建系统进化树ꎮ
１.２.４ ＰｈＮＡＣ１ 基因的表达特性分析 取蝴蝶兰的 ２.１ ＰｈＮＡＣ１ 基因全长的扩增
根、叶(第 ２ 片)、花葶、花芽、萼片、翼瓣、唇瓣及蕊 以蝴蝶兰叶片 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ以引物 ＰｈＮＡＣ１￣Ｆ
柱ꎬ迅速投入液氮中速冻后－８０ ℃ 冰箱保存ꎬ用于 和 ＰｈＮＡＣ１￣Ｒ 进行中间片段的扩增ꎬ得到约 ３５０
ＰｈＮＡＣ１ 基因在不同组织中的表达分析ꎮ 低温胁 ｂｐ 的保守片段( 图 １:Ａ)ꎬ经 ＢＬＡＳＴｎ 比对分析表

迫处理均取第 ２ 片成熟叶ꎬ每个取样点有三个生 明克隆的片段为 ＮＡＣ 基因片段ꎮ 根据该片段序
物学重复ꎬ每个重复由三株不同植株混合而成ꎮ 列ꎬ利用引物 ＧＳＰ３￣１ 和 ＧＳＰ３￣２ 进行 ３′￣ＲＡＣＥ 扩
根据 得 到 的 ＯＲＦ 序 列ꎬ 设 计 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 引 物 增ꎬ得到大小约 ７８０ ｂｐ 目的片段(图 １:Ｂ)ꎬ利用引
ＰｈＮＡＣ１￣ｑＦ 和 ＰｈＮＡＣ１￣ｑＲꎬ以蝴蝶兰 Ａｃｔｉｎ 基因作 物 ＧＳＰ５￣１ 和 ＧＳＰ５￣２ 进行 ５′￣ＲＡＣＥ 扩增ꎬ得到大
为内参基因ꎮ 采用 ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ 试剂盒进 小约 ３２０ ｂｐ 目的片段(图 １:Ｃ)ꎮ 将测序得到的中

行 ｑＲＴ￣ＰＣＲꎬ反应体系为 ２５ μＬꎬ反应条件:９５ ℃ １５ 间保守区片段、５′￣ＲＡＣＥ 扩增片段及 ３′￣ＲＡＣＥ 扩
ｓꎬ５８ ℃ １５ ｓꎬ７２ ℃ １５ ｓ(４０ 个循环)ꎬ反应在 Ｅｐｐｅｎ￣ 增片段进行分析拼接ꎬ得到全长为 １ ４４２ ｂｐ 的基
ｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ 荧光定量 ＰＣＲ 仪上进行ꎬ每个样品 因序列ꎬ其中包括一个完整的长为 ９４２ ｂｐ ＯＲＦꎬ编
重复 ３ 次ꎬ同时做阴性对照ꎮ 基因相对表达量用公 码 ３１３ 个氨基酸ꎮ 对 ＯＲＦ 区进行克隆验证ꎬ得到
－ΔΔＣｔ ９９７ ｂｐ 的片段(图 １:Ｄ)ꎬ 与全长部分序列完全相
式 ２ 来计算(Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００２)ꎮ

Ｍ. ＤＬ２０００ ＤＮＡ 标记ꎻ １. 中间保守片段ꎻ ２. ３′￣ＲＡＣＥ 片段ꎻ ３. ５′￣ＲＡＣＥ 片段ꎻ ４. 开放阅读框ꎮ
Ｍ. ＤＬ２０００ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ １. Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎꎻ ２. ３′￣ＲＡＣＥ ｒｅｇｉｏｎꎻ ３. ５′￣ＲＡＣＥ ｒｅｇｉｏｎꎻ ４. ＯＲＦ.
图 １ 蝴蝶兰 ＰｈＮＡＣ１ 基因的扩增
Ｆｉｇ. １ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰｈＮＡＣ１ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ

同ꎮ 经 ＢＬＡＳＴ 分析ꎬ 所得的核苷酸序列与小兰屿 表明该蛋白属于植物特有的 ＮＡＣ 转录因子家族ꎮ
蝴蝶兰( Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｅｑｕｅｓｔｒｉｓꎬ ＸＰ ＿０２０５７６３７９) 一 ＣＤＤ 数据库分析结果表明ꎬ该蛋白第 ８ 至第 １３４
致性为 ９８％ꎬ与小野芭蕉( Ｍｕｓａ ａｃｕｍｉｎａｔａ) ＮＡＣ７９ 个氨基酸为 ＮＡＣ 结构域ꎮ 生物信息分析结果表明
基因序列一致性为 ７９％ꎬ通过比对分析表明克隆 ＰｈＮＡＣ１ 蛋白属于亲水性蛋白ꎬ该蛋白分子质量约
的 基 因 为 ＮＡＣ 家 族 基 因ꎮ 将 该 基 因 命 名 为 为 ３５.２２ ｋＤａ、理 论 等 电 点 ｐＩ 为 ６. ９５ꎬ分 子 式 为
ＰｈＮＡＣ１ꎬＧｅｎＢａｎｋ 登录号 ＭＦ７９７９０９ꎮ Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ Ｓ ꎻ正负电荷残基总数均为 ３５ꎮ
１５６３ ２３７５ ４１７ ４７７ １８
２.２ ＰｈＮＡＣ１ 基因的生物信息学分析 在组成 ＰｈＮＡＣ１ 蛋白的 ２０ 种氨基酸中ꎬＳｅｒ 所占
２.２.１ ＰｈＮＡＣ１ 蛋白的基本性质及空间结构分析 的比例最高ꎬ为 １０.２％ꎬＨｉｓ 和 Ｃｙｓ 所占比例最低ꎬ
通过对 ＰｈＮＡＣ１ 基因推导的氨基酸序列进行分析ꎬ 仅为 １.６％ꎮ 该蛋白脂肪指数 ５６.１０ꎬ不稳定指数