Page 121 - 《广西植物》2020年第6期
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６ 期 徐梦璇等: 马尾松细胞分裂素羟化酶基因 ＰｍＣＹＰ７３５Ａ 克隆与表达分析 ８ ６ ７
表 １ ＰｍＣＹＰ７３５Ａ 的引物序列
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＰｍＣＹＰ７３５Ａ
引物名称 正向引物 (５′￣３′) 反向引物 (５′￣３′)
Ｐｒｉｍｅｒ＿ＩＤ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ (５′￣３′) Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ (５′￣３′)
基因片段 ＡＣＡＴＡＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧ ＣＣＴＣＣＴＴＣＴＴＴＡＧＴＴＣＣＡＡＣＡＣＣ
Ｕｎｉｇｅｎｅ
３′ＲＡＣＥ 外引物 ＧＧＣＴＡＡＴＧＧＣＧＡＡＧＡＣＴＧＧＧＣＧＡＡＣ ＡＣＴＣＴＧＣＧＴＴＧＡＴＡＣＣＡＣＴＧＣＴＴＧＣＣＣＴＡ￣
３′Ｏｕｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒ ＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＧ
３′ＲＡＣＥ 内引物 ＧＴＧＧＡＧＡＴＴＧＡＧＧＴＧＧＧＣＧＡＧＣＡＴＴ ＧＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＧ
３′ Ｉｎｎｅｒ ｐｒｉｍｅｒ
５′ＲＡＣＥ 外引物 ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴ￣ ＣＣＡＣＣＴＣＡＡＴＣＴＣＣＡＣＡＧＴＴＣＣＧＣＣ
５′ Ｏｕｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒ ＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ
５′ＲＡＣＥ 内引物 ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ ＣＴＡＴＧＡＣＡＣＧＣＣＧＣＴＧＧＴＴＣＧＣ
５′ Ｉｎｎｅｒｐｒｉｍｅｒ
开放阅读框 ＡＴＧＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＧ ＣＴＡＴＧＧＡＴＣＡＡＴＴＣＴＧＡＴＴＧＴＴＧ
ＯＲＦ
实时定量 ＧＧＣＧＴＴＧＴＴＣＴＣＧＡＣＴＴＣＣＧ ＧＡＧＣＡＧＣＡＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＴ
ＰＣＲ ｑＲＴ￣ＰＣＲ
内参基因 ＡＧＣＴＣＣＧＡＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＡＡ ＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＣＧＴＡＣＴＴＴＧＧ
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ
编码蛋白质分子式为 Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ Ｓ ꎬ相对分 (Ｔａｋｅｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００４) 和 麻 风 树 ( Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓꎬ
２７９３ ４４０６ ７７０ ７７３ ２６
子质量 ( ＭＷ) 为 ６１. ９３ ｋＤꎬ 理 论 等 电 点 ( ｐＩ) 为 ＸＰ＿０１２０７７９７１.１)(Ｃａｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)的一致性分别
９.３７ꎻ不稳定系数为 ３７.０４ꎬ为稳定蛋白ꎻ总亲水性 为 ５１％ 和 ５２％ꎮ 将 ＰｍＣＹＰ７３５Ａ 蛋 白 与 拟 南 芥
平均系数为－０.１１８ꎬ预测其为亲水性蛋白ꎮ ＡｔＣＹＰ７３５Ａ１ 和 ＡｔＣＹＰ７３Ａ２、麻风树 ＪｃＣＹＰ７３５Ａ、
２.２ 二级结构与三级结构预测 水 稻 ＯｓＣＹＰ７３５Ａ３ ( Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａꎬ ＸＭ ＿
马尾松 ＣＹＰ７３５Ａ 基因编码蛋白不含跨膜区 ０１５７９４０４６.２)和 ＯｓＣＹＰ７３５Ａ４(ＸＭ＿０１５７５５２７６.１)
域ꎬ预测位于内质网ꎬ且无信号肽酶切位点ꎬ推测 和玉 米 ＺｍＣＹＰ７３５Ａ ( Ｚｅａ ｍａｙｓꎬ ＰＷＺ ＿ ２５３８４. １)
该编码蛋白为非分泌性亲水性蛋白ꎮ 其二级结构 (李晓丽ꎬ２０１１)等已有文献报道的 ＣＹＰ７３５Ａ 同源
含有 ５２.５５％的 α￣螺旋( Ａｌｐｈａ ｈｅｌｉｘ)、１０.９５％的延 蛋白进行多重序列比对( 图 ３)ꎮ 所有已知的细胞
伸链 ( Ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｔｒａｎｄ )、 ４. ７４％ 的 β￣转 角 ( Ｂｅｔａ 色素 Ｐ４５０ 家族成员都含有保守的血红素结合域
ｔｕｒｎ)和 ３１.７５％ 的无规则卷曲( Ｒａｎｄｏｍ ｃｏｉｌ) ( 图 (ｈｅｍｅ￣ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ)ꎬ 通 过 多 序 列 比 对 发 现 在
２:Ａ)ꎮ 以 ＣＹＰ ＢＭ３( Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｐｅｎｔａｍｕｔａｎｔ ＰｍＣＹＰ７３５Ａ 蛋白在 ３９９ ~ ４０６ 个和 ４７５ ~ ４８４ 个氨
ｆｒｏｍ ＢＭ３ ｗｉｔｈ ｂｏｕｎｄ ＰＥＧ) ( ＳＭＩＴ ＩＤ:４ｚｆ６.１) 为模 基酸残基存在保守特征序列 ＥＴＬＲＬＹＰ( ＥｘｘＲｘｘＰ)
板ꎬ获得马尾松 ＰｍＣＹＰ７３５Ａ 蛋白质三级结构( 图 (Ｈａｓｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９４)和血红素结合区域(ｈｅｍｅ￣
２:Ｂ)ꎬ两者的序列具有 ２６.２６％的一致性ꎬ模板覆 ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ) ＦＳＦＧＰＲＫＣＶＧ ( ＦｘｘＧｘＲｘＣｘＧ )
盖率为 ８３％ꎮ (Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９３)ꎮ
２.３ 马尾松 ＣＹＰ７３５Ａ 蛋白质保守结构域分析 ２.４ ＣＹＰ７３５Ａ 蛋白系统进化分析
Ｐｆａｍ 数 据 库 检 索 显 示ꎬ 马 尾 松 ＰｍＣＹＰ７３５Ａ 将上述已有文献报道的 ＣＹＰ７３５Ａ 家族蛋白
蛋白质在 ４ ~ ３４９ 个氨基酸残基范围内存在 Ｐ４５０ 与 可 可 ＴｃＣＹＰ７３５Ａ ( Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏꎬ ＥＯＹ ＿
蛋白的保守结构域ꎮ 目前ꎬ有关 ＣＹＰ７３５Ａ 亚家族 ０４２０８.１)、向日葵 ＨａＣＹＰ７３５Ａ( Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓꎬ
蛋白的功能研究较为缺乏ꎬＮＣＢＩ 数据库 Ｂｌａｓｔ 比对 ＯＴＧ＿０５７００.１)、毛果杨 ＰｔＣＹＰ７３５Ａ( Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏ￣
显示ꎬ 马 尾 松 ＰｍＣＹＰ７３５Ａ 氨 基 酸 序 列 与 拟 南 ｃａｒｐａꎬＸＰ ＿００６３８３４６２)、 蓖 麻 ＲｃＣＹＰ７３５Ａ ( Ｒｉｃｉｎｕｓ
ＣＹＰ７３５Ａ１(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａꎬＮＰ＿００１３３１４３７.１) ｃｏｍｍｕｎｉｓꎬＸＭ＿００２５１６６７７.２)、橡胶树 ＨｂＣＹＰ７３５Ａ
