Page 119 - 《广西植物》2020年第6期

６ 期 徐梦璇等: 马尾松细胞分裂素羟化酶基因 ＰｍＣＹＰ７３５Ａ 克隆与表达分析 ８ ６ ５

ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ. Ｉｔ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｉｓｏｐｒｅｎｙｌ ａｄｅｎｉｎｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓ￣ｚｅａｔｉｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｌａｙｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ. Ｕｐ ｔｏ ｎｏｗꎬ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｆｅｗ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ ａｂｏｕｔ ｇｅｎｅ
ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｉｎ ｗｏｏｄｙ ｐｌａｎｔｓ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ｏｎｅ ＣＹＰ７３５Ａ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｆｉｒｓｔｌｙ
ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｉｎ Ｐｉｎｕｓ ｍａｓｓｏｎｉａｎａ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ (ＲＡＣＥ). Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ａｓ
ｆｏｌｌｏｗｓ: Ｔｈｅ ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｃＤＮＡ ｏｆ ＰｍＣＹＰ７３５Ａ ｗａｓ １ ７４４ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓꎬ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ １ ６４７ ｂｐ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ (ＯＲＦ)ꎬ
４４ ｂｐ ５′￣ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ (ＵＴＲ) ａｎｄ ５３ ｂｐ ３′￣ＵＴＲ. ＰｍＣＹＰ７３５Ａ ｅｎｃｏｄｅｄ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ５４８ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓꎬ ａｎｄ ｉｔｓ
ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｗａｓ ｒｉｃｈ ｉｎ ａｌｐｈａ ｈｅｌｉｘ ａｎｄ ｒａｎｄｏｍ ｃｏｉｌ. ＰｍＣＹＰ７３５Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｄ ｎｏｔ ｃｏｎｔａｉｎ ｅｉｔｈｅｒ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ
ｒｅｇｉｏｎ ｏｒ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ. Ｂｕｔ ｔｗｏ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｍｏｔｉｆｓ ｏｆ Ｐ４５０ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｓｕｃｈ ａｓ ＥＴＬＲＬＹＰ (ＥｘｘＲｘｘＰ)
ａｎｄ ｈｅｍｅ￣ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ＦＳＦＧＰＲＫＣＶＧ (ＦｘｘＧｘＲｘＣｘＧ) ｗｅｒｅ ｅｘｉｓｔｅｄ ｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ３９９－４０６ ａａ ａｎｄ ４７５－
４８４ ａａꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＰｍＣＹＰ７３５Ａ ｗａｓ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｂｒａｎｃｈ
ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａꎬ Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ａｎｄ Ｚｅａ ｍａｙｓꎬ ｗｈｉｌｅ ＣＹＰ７３５Ａ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ
Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏꎬ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ ａｎｄ Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ ｗｅｒｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ｉｎ ａｎｏｔｈｅｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｂｒａｎｃｈ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ
ｑＲＴ￣ＰＣＲ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＰｍＣＹＰ７３５Ａ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ｒｏｏｔｓ ａｎｄ ｓｔｅｍｓ ｔｈａｎ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ. Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬ ｔｈｅ
ｇｅｎｅ ｒｅｓｐｏｎｄｅｄ ｔｏ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ａｕｘｉｎ ＮＡＡ ｗｉｔｈ ａ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｆｉｒｓｔｌｙ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｒｅｎｄ ｏｖｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｔｉｍｅ ｉｎ ａｌｌ ｔｈｒｅｅ ｔｉｓｓｕｅｓ. Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｉｌｌ ｂｅ ｖａｌｕａｂｌｅ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＹＰ７３５Ａ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ
ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｗｏｏｄｙ ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｅｎｒｉｃｈ ｔｈｅ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ Ｐｉｎｕｓ ｍａｓｓｏｎｉａｎａ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅꎬ ＲＡＣＥꎬ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎꎬ Ｐｉｎｕｓ ｍａｓｓｏｎｉａｎａꎬ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ

细胞分裂素( ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ) 是一类促进细胞分裂 径的了解和认知源于几种关键酶及其编码基因的
与分化的腺嘌呤衍生物ꎬ根据其嘌呤环第 ６ 位氮 发现(Ｔａｋｅｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００４ꎻＳａｋａｋｉｂａｒａꎬ２００６ꎻ邓岩等ꎬ

原子(Ｎ )上侧链结构ꎬ天然细胞分裂素可分为异 ２００６ꎻ李志康等ꎬ２０１８)ꎮ 异戊烯基转移酶( ｉｓｏｐｅｎ￣
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戊二烯类和苯环类ꎬ后者在植物体内含量极微ꎮ ｔｅｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅꎬ ＩＰＴ) 是 细 胞 分 裂 素 合 成 的 限 速
异戊二烯类是细胞分裂素在植物体内的主要存在 酶ꎬ可催化磷酸腺苷( ＡＴＰ / ＡＤＰ / ＡＭＰ) 与二甲基
形式ꎬ包括反式玉米素( ｔｒａｎｓ￣ｚｅａｔｉｎꎬｔＺ)、异戊烯基 丙烯基二磷酸( ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅꎬＤＭＡＰＰ)

腺嘌呤( ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ ａｄｅｎｉｎｅꎬｉＰ)、顺式玉米素( ｃｉｓ￣ 作用 转 化 为 磷 酸 异 戊 烯 基 腺 苷 ( ｉＰＲＴＰ / ｉＰＲＤＰ /
ｚｅａｔｉｎꎬｃＺ)、二氢玉米素( ｄｉｈｙｄｒｏｚｅａｔｉｎꎬＤＺ) 以及它 ｉＰＲＭＰ)ꎬ继 而 产 生 异 戊 烯 基 腺 苷 ( ｉＰ ｒｉｂｏｓｉｄｅꎬ
们的核苷、 核 苷 酸 和 糖 苷 等 ( Ｔａｋｅｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００４ꎻ ｉＰＲ)ꎻ细胞分裂素羟化酶 ＣＹＰ７３５Ａ 能将上述磷酸
Ｓａｋａｋｉｂａｒａꎬ２００６)ꎻ不 同 结 构 形 态 ( ｉＰ / ｔＺ / ｃＺ 及 其 异戊烯基腺苷经羟基化转化为反式玉米素核苷
核苷、核苷酸和糖苷等)的功效组分在不同植物和 (ｔＺＲＴＰ / ｔＺＲＤＰ / ｔＺＲＭＰ)ꎬ并合成反式玉米素核苷
同种植物的不同组织器官或发育阶段会有较大差 (ｔＺ ｒｉｂｏｓｉｄｅꎬｔＺＲ)ꎮ ＬＯＮＥＬＹ ＧＵＹ( ＬＯＧ) 基因编码
异ꎬ同时它们在特定条件下还可以相互转化以维 的磷酸核糖水解酶可以进一步将 ｉＰＲ 和 ｔＺＲ 转化

持和调节游离态细胞分裂素的活性水平( 张红梅 为具有生物活性的、自由基形式的 ｉＰ 和 ｔＺꎬ与此同
等ꎬ２００３ꎻＫｉｅｂｅｒ ＆ Ｓｃｈａｌｌｅｒꎬ２０１８)ꎮ 细胞分裂素的 时ꎬ细胞分裂素的合成代谢还受到细胞分裂素氧
生物合成有两种方式ꎬ即 ｔＲＮＡ 分解和从头合成ꎮ 化酶、Ｎ￣葡糖基转移酶、玉米素￣Ｏ￣葡糖基转移酶和
ｔＲＮＡ 通过释放出 ｃＺ 并在顺反异构酶的催化下转 β￣葡糖苷酶等的精确调控( 邓岩等ꎬ２００６ꎻ李志康
化成高活性 ｔＺꎬ这条途径是其生物合成的次要途 等ꎬ２０１８ꎻＫｉｅｂｅｒ ＆ Ｓｃｈａｌｌｅｒꎬ２０１８)ꎮ

径( Ｍｏｋ ＆ Ｍｏｋꎬ ２００１ꎻ Ｈａｂｅｒｅｒ ＆ Ｋｉｅｂｅｒꎬ ２００２ꎻ 马尾松(Ｐｉｎｕｓ ｍａｓｓｏｎｉａｎａ) 是松科松属针叶树
Ｖｅａｃｈ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００３)ꎻ以异戊烯基侧链为底物的从 种ꎬ为多年生常绿乔木ꎬ在苏、皖、浙、湘、赣、闽、云
头合成是大多内源细胞分裂素产生的主要途径 贵及两广地区均有分布ꎮ 马尾松长势快、干形通
(邓岩等ꎬ２００６)ꎮ 人们对细胞分裂素从头合成途 直且耐干旱贫瘠ꎬ是我国南方地区重要的荒山造