Page 99 - 《广西植物》2022年第12期

１２ 期 冼康华等: 不同生长年限华重楼根际土壤微生物多样性研究 ２ ０ ８ ９

影响规律ꎬ为人工栽培华重楼及探寻其根茎病害 表 １ 不同生长年限华重楼根际土壤信息
发生的生理生态机制及相应的生物防治方法提供 Ｔａｂｌｅ １ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌｓ ｏｆ Ｐａｒｉｓ
ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ ｖａｒ. ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｙｅａｒｓ
科学依据ꎮ
样品编号 生长年份 采集地点 经纬度 海拔
１ 材料与方法 Ｓａｍｐｌｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｌａｔｉｔｕｄｅ ａｎｄ Ａｌｔｉｔｕｄｅ
(ｍ)
ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ
ｙｅａｒｓ
ｌｏｃａｔｉｏｎ
ｃｏｄｅ
ＪＹ１ ３ 年 金秀香草岭 １１０°１２′２３″ Ｅ １ ３００
１.１ 土壤样品采集和处理 ３ ｙｅａｒｓ Ｖａｎｉｌｌａ Ｒｉｄｇｅ ２４°８′５４″ Ｎ
华重楼每年冬季地上部茎秆倒伏ꎬ根茎上会 ｉｎ Ｊｉｎｘｉｕ
Ｃｏｕｎｔｙ
留下刻痕ꎬ常规可以按根茎上刻痕的数量来判断
ＪＹ２ ５ 年 金秀香草岭 １１０°１２′１０″ Ｅ １ ２５０
不同生长年限( 苏海兰等ꎬ２０２０)ꎮ 土样采集按照 ５ ｙｅａｒｓ Ｖａｎｉｌｌａ Ｒｉｄｇｅ ２４°８′５５″ Ｎ
ｉｎ Ｊｉｎｘｉｕ
鲍士旦的方法( 鲍士旦ꎬ２０００)ꎬ２０１８ 年 ９ 月在广 Ｃｏｕｎｔｙ
西金秀县华重楼野外自然分布区采用随机多点混 ＪＹ３ ７ 年 金秀香草岭 １１０°１２′１０″ Ｅ １ ２００
７ ｙｅａｒｓ Ｖａｎｉｌｌａ Ｒｉｄｇｅ ２４°８′５７″ Ｎ
合的原则ꎬ每个采样点选取生长健康、长势一致、 ｉｎ Ｊｉｎｘｉｕ
刻痕数相同(１ 个刻痕代表生长 １ ａ) 的华重楼 １０ Ｃｏｕｎｔｙ
株ꎬ收集根系及附着其上 ０ ~ ０.５ ｃｍ 的土壤作为根 ＪＹ４ ９ 年 金秀香草岭 １１０°１２′１２″ Ｅ １ ２１０
９ ｙｅａｒｓ Ｖａｎｉｌｌａ Ｒｉｄｇｅ ２３°５４′６０″ Ｎ
际土ꎬ将混匀的根际土壤放入无菌塑料袋中ꎬ用标 ｉｎ Ｊｉｎｘｉｕ
Ｃｏｕｎｔｙ
签记录采样的信息ꎬ放入户外保鲜箱后立即带回
实验室ꎬ每个采样点 ３ 次重复ꎮ 每个土壤样品采
集后分成 ２ 份:一份置于－８０ ℃ 下保存ꎬ用于土壤 １.２.２ 微生物组测序数据质控与分析 对测序得到
ＤＮＡ 提 取 及 后 续 的 细 菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ 和 真 菌 １８Ｓ 的原始数据进行拼接质控ꎬ得到有效数据ꎮ 采用
ｒＲＮＡ 测序ꎻ另一份室内自然风干ꎬ研磨ꎬ过 ２ ｍｍ
Ｕｐａｒｓｅ 软 件 平 台 进 行 ＯＴＵ ( ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ
筛ꎬ用于土壤理化性质测定ꎮ 由于野生华重楼生长 ｕｎｉｔｓ)聚类和物种信息分析ꎮ ＯＴＵ 聚类步骤:(１)对
年份的不可控性ꎬ根据本次采样的实际情况结合重 优化序列提取非重复序列ꎬ便于降低分析中间过程
楼主要药用成分重楼皂苷的积累规律 ( 张烨 等ꎬ 冗余计算量ꎻ(２) 去除没有重复的单序列ꎻ(３) 按照
２０１１ꎻ王琳娜等ꎬ２０１８)ꎬ因此选择 ３ 年生、５ 年生、７ ９７％相似性对非重复序列(不含单序列) 进行 ＯＴＵ
年生和 ９ 年生 ４ 个不同生长年限华重楼的根际土样 聚类ꎬ在聚类过程中去除嵌合体ꎬ得到 ＯＴＵ 的代表
开展土壤微生物多样性研究ꎬ土壤信息如表 １ 所示ꎮ 序列ꎻ(４)将所有优化序列 ｍａｐ 至 ＯＴＵ 代表序列ꎬ
１.２ 根际土壤微生物群落组成及多样性分析 选出与代表序列相似性在 ９７％ 以上的序列ꎬ生成
１.２. １ 土 壤 微 生 物 ＤＮＡ 的 提 取、 ＰＣＲ 扩 增 和 测 ＯＴＵ 表格ꎮ 采用 ＲＤＰ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ 贝叶斯算法对 ９７％
序 土壤微生物总 ＤＮＡ 使用上海生工生物工程股 相似水平的 ＯＴＵ 代表序列进行分类学分析ꎮ
份有限公司的土壤基因组 ＤＮＡ 快速抽提试剂盒提 １.２.３ 根际土壤微生物组成分析 基于测序的数
取ꎻ提取后 ＤＮＡ 样品用干冰寄送到上海美吉生物医 据ꎬ利用 Ｍｏｔｈｕｒ 软件分析不同随机抽样下的 Ａｌｐｈａ
药科技有限公司进行测序ꎮ 整个上机流程ꎬ包括 多样性反映微生物群落的丰富度和多样性ꎬ包括
ＰＣＲ 的扩增、 ＰＣＲ 产物的混样和纯化及文库的构 Ａｃｅ、Ｃｈａｏ、Ｓｉｍｐｓｏｎ 和 Ｓｈａｎｎｏｎ 等指数ꎮ 其中ꎬＡｃｅ
建ꎮ 对细菌 Ｖ３ ~ Ｖ４ 区进行扩增的引物采用 ３３８Ｆ 和 Ｃｈａｏ 指数反映样本中群落的丰富度ꎬＳｉｍｐｓｏｎ
(５′￣ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ￣３′) 和 ８０６Ｒ ( ５′￣ 和 Ｓｈａｎｎｏｎ 指数反映群落的多样性ꎬＡｃｅ、Ｃｈａｏ 和
ＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ￣３′)ꎮ 扩 增 程 序: ９５ Ｓｈａｎｎｏｎ 指数越大ꎬＳｉｍｐｓｏｎ 指数越小ꎬ说明样品的
℃预变性 ３ ｍｉｎꎻ９５ ℃ 变性 ３０ ｓꎻ５３ ℃ 退火 ３０ ｓꎻ７２ 物种多样性越高ꎻ利用 Ｒ 语言工具生成土壤微生
℃ 延伸 ４５ ｓꎻ持续 ２８ 个循环周期ꎻ７２ ℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ 物群落柱形图ꎻＶｅｎｎ 图可用于统计多组或多个样
对真菌 Ｖ５ ~ Ｖ７ 区进行扩增的引物采用 ＳＳＵ０８１７Ｆ 本中所共有和独有的 ＯＴＵ 数目ꎬ采用 Ｒ 语言工具
(５′￣ＴＴＡＧＣＡＴＧＧＡＡＴＡＡＴＲＲＡＡＴＡＧＧＡ￣３′)和 １１９６Ｒ 和作图生成ꎮ
(５′￣ＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＡＧＴＴＴＣＣ￣３′)ꎮ 扩 增 程 序: １.２.４ 根际土壤微生物群落结构差异性分析 通
９５ ℃ 预变性 ３ ｍｉｎꎻ９５ ℃ 变性 ３０ ｓꎻ５３ ℃ 退火 ３０ 过对不同样品微生物群落间进行 Ｂｅｔａ 多样性分
ｓꎻ７２ ℃ 延伸 ４５ ｓꎻ持续 ３７ 个循环周期ꎻ７２ ℃ 延伸 析ꎬ探索不同样品间群落组成的相似性或差异性ꎻ
１０ ｍｉｎꎮ 扩增产物利用美吉生物 Ｉｌｌｕｍｉｎａ 平台进 用 Ｑｉｉｍｅ 数据分析流程计算 Ｂｅｔａ 多样 性 距 离 矩
行测序ꎮ 阵ꎬ用 Ｒ 语言进行 ＵＰＧＭＡ 聚类分析并作树状图ꎮ