Page 96 - 《广西植物》2023年第4期

ᤃ Ꭾ ऐ 广জ 西জ 植জ 物 ࿗ሕ 卷
۪኏኏ँ 是中央振荡器早循环的关键组分ᖔ在调控植 ϓॹԣ 花青素含量的测定
物生长发育和响应逆境胁迫方面发挥了重要作用 在长日照条件下生长 ᤃʛ 的拟南芥幼苗ྉ包括
ྉ୩ᑕႿዹၤᔀझ ᪲ ᣽ᑕᢃᖔ ԰ԡϟᤃɯᤥ 生物钟与花青素均在植 ऊᆍ᤟᥋ԡܦ ᡓʗʗጢ᥋ϟܦ ᡓʗʗጢ᥋԰ܦ ᡓʗʗᎮ᥋ϟܦ ᡓʗʗᎮ᥋԰ܦ ᡓʗʗጢ ᡓʗʗᎮܦ ᡓʗʗጢ
物响应逆境胁迫中发挥重要功能 ྉ ۼᔀᔽ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ ᡓʗʗँܦᡓʗʗጢ ᡓʗʗᎮ ᡓʗʗँ 和 ሕጢ୒᧥ۗቴቴጢ᤬Þᒦዛᤩ 等ɯᖔ于当天
԰ԡϟऐଫ ୩ᆍႿ੫ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ ԰ԡ԰ϟɯᖔ但关于生物钟信号调控 光照的第 ϟԡ 个小时ྉԻఋ ϟԡɯ进行取样并称重ྉ੫ɯᖔ
花青素合成的研究尚未见报道ᤥ 近期有研究表 加入 ϟቝᓂ 花青素提取液 ྉ 甲醇ܦ 盐酸体积比为
明ᖔ生物钟 ۪኏኏ 蛋白能够促进 ዶାዶ 信号抑制种子 ँँ ᨒ ϟɯᤥ ࿗ ቩ 黑暗条件下振荡 ԰࿗ ၤᖔϟሕ ԡԡԡ ʢኼ
萌发及萌发后生长ྉɟᑕႿ੫ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ ԰ԡ԰ϟɯᖔ而 ዶାዶ 信 ቝᔽႿ 离心 ϟԡ ቝᔽႿ 后吸取上清液ᤥ 以花青素提取液
᥋ϟ
号可以诱导拟南芥幼苗中花青素的合成与积累 作为空白对照ᖔ 使 用 分光光度计测量上清液在
ྉऊၤᔀႿ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ ԰ԡ԰ԡɯᤥ 那么ᖔ生物钟 ۪኏኏ 蛋白是否 ጢሕԡܦᤃጢᎮ Ⴟቝ 波长处的吸光度ྉ ዛ ጢሕԡ 和 ዛ ᤃጢᎮ ɯᤥ 花青
与花青素合成直接相关呢ᥳ 本研究以拟南芥为材 素相对含量用公式ྉ ዛ ͱ ԡॹ԰ጢ ġዛ ɯ੫ èۼ 计算
᥋ϟ
ጢሕԡ ᤃጢᎮ
料ᖔ通过分子生物学和遗传学相关的方法ᖔ探究了 ྉऊၤᔀႿᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ԰ԡ԰ԡɯᤥ 实验至少进行 ሕ 次生物学
生物钟 ۪኏኏ 蛋白促进拟南芥幼苗花青素合成的生 重复ᤥ
物学功能及其分子机制ᤥ 这对于发掘 ۪኏኏ 蛋白新 ϓॹᇺ 拟南芥 ቴટዛ 提取和 ቴ௴᤬फۗࣷቴ
的生物学功能ᖔ深入理解生物钟信号调控植物幼 在长日照条件下生长 ᤃʛ 的拟南芥幼苗ᖔ于当
天光照 的 第 ϟԡ 个小时 ྉԻఋ ϟԡɯ 进行取样ᖔ 使用
苗的环境适应性具有重要意义ᤥ
ఋʢᔽझᆍ᤟ 试剂提取拟南芥幼苗 总 ኏શዶᖔ 逆转录成
ϟজ 材料与方法 ዹ᧕શዶ 后进行 ኏ఋ᥋ी۪ऊ኏ 反应ྉ ̀ᑕႿ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ ԰ԡ԰ԡɯᤥ
用于 ኏ఋ᥋ी۪ऊ኏ 实验的引物如表 ϟ 所示ᖔ基因表达

ϓॹϓ 植物材料及生长条件 的内参使用拟南芥 ዛࣷ௴ᧇટ԰ 基因ᤥ 实验至少进行 ሕ
所使用的野生型ྉۼఋɯܦ突变体和过表达拟南 次生物学重复ᤥ
芥植物均属于哥伦比亚ྉऊᆍ᤟᥋ԡɯ 遗传背景ᖔ突变体
表 ϓই ቴ௴᤬फۗࣷቴ 的引物
种子 ᡓʗʗጢ᥋ϟ ྉ ୩ዶᓂ᣽ ᡸ ԡԡᤃ԰ऐԡ ɯܦ ᡓʗʗጢ᥋԰ ྉ ୩ዶᓂ᣽ ᡸ
ఋᑕᤦ᤟ᔀ ϟজ ۪ʢᔽቝᔀʢ༁ ᆍ஦ ኏ఋ᥋ी۪ऊ኏
ϟሕጢԡԡԡऊ ɯܦ ᡓʗʗᎮ᥋ϟ ྉ ୩ዶᓂ᣽ ᡸ ԡँϟጢᤃँऊ ɯ 和 ᡓʗʗᎮ᥋԰
ྉ୩ዶᓂ᣽ᡸԡሕԡ࿗ሕԡऊɯ 来源于俄亥俄州立大学的拟南 基因名称 正向引物 反向引物
᥈ᔀႿᔀ Ⴟᑕቝᔀ èᆍʢऔᑕʢʛ ᡱʢᔽቝᔀʢ ኏ᔀ׹ᔀʢ༁ᔀ ᡱʢᔽቝᔀʢ
芥资源中心ᖔᡓʗʗጢ ᡓʗʗᎮ 双突变体是通过 ᡓʗʗጢ᥋ϟ 和
ዛࣷ௴ᧇટ԰ ఋ᥈ఋ᥈ऊऊዶዶఋऊఋዶऊ᥈ዶ᥈᥈ ఋఋఋऊऊऊ᥈ऊఋऊఋ᥈ऊఋ᥈ఋఋ᥈ఋ
ᡓʗʗᎮ᥋԰ 采 用 遗传杂交得到ᖔ ᡓʗʗጢ ᡓʗʗँ 和 ᡓʗʗጢ ᡓʗʗᎮ ᥈ఋఋఋ
ᡓʗʗँ 由中国科学院植物研究所王雷研究员提供ᖔ ᦵÞቴ ఋ᥈᥈ఋ᥈᥈ఋऊ᥈᥈ఋऊऊዶఋఋऊ ᥈ዶ᥈ዶ᥈ዶ᥈ऊ᥈ऊ᥈᥈ఋ᥈ዶఋዶ
ዶఋ ዶ᥈᥈
ቂᡥᤇ᤬ቴટዛᔠ 由杨洪全教授提供ᤥ 为了获得 ሕጢ୒᧥
ᒦᦵ᧣ᣏ ఋऊऊ᥈᥈᥈ఋఋఋ᥈ऊዶ᥈ऊఋఋఋ ዶఋऊዶ᥈᥈ዶዶऊዶऊዶఋఋఋఋ᥈ऊ
ۗቴቴጢ᤬Þᒦዛᤩ 转基因植株ᖔ将 ԰èᓂዶ᥈ 标签序列连接 ఋऊ ዶ᥈ఋ᥈ዶ
的 ۗቴቴጢ 全长 ዹ᧕શዶ༁ᖔ使用 ୒ቂᐹ᧧ 和 ᣏᤇᐹ᧧ 酶切位点 ІÞሕᤩ௴ ఋ᥈᥈ዶ᥈᥈ఋ᥈᥈ऊ᥈᥈ఋఋ ऊఋఋఋ᥈ऊऊ᥈ऊ᥈ዶ᥈ዶዶऊऊዶ
克隆到由 ࣷᐹ᤹Ⴌ ሕጢ୒ 启动的 ᡱᨃऊዶሕԡ 载体ᖔ经农杆 ᥈ዶዶ
菌转化野生型ྉऊᆍ᤟᥋ԡɯ 拟南芥获得 ఋ 代纯合 ۗቴቴጢ
ሕ
过表达植物ྉɟᑕႿ੫ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ ԰ԡ԰ϟɯᤥ 根据需要选取适 ϓॹ྽ 酵母双杂交实验 ཯ɔԣ̵ɤ
量拟南芥突变体种子ܦ过表达种子和野生型种子ᖔ 使用酵母双杂交系统ྉ ̀ࣼ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ ԰ԡϟँɯ 筛选
加入 ԰ԡᠮ种子消毒液ྉ 立白白衣漂渍液ɯ 浸泡 ऐ 可能与生物钟 ۪኏኏ 蛋白相互作用的花青素合成调
ቝᔽႿᖔ使用无菌水清洗 ሕጲጢ 次ᖔ播种于含有 ϟᠮྉ ቂᣑ 控蛋白ᤥ 将 ۪኏኏ጢܦ۪኏኏Ꭾ 与 ۪኏኏ँ 的全长编码序
Ⴌɯ蔗糖的 ϟᣰ ԰ ᥘ୩ 固体培养基上ྉᡱ̀ ጢ঎ऐɯᤥ ࿗ ቩ 列克隆到 ᡱ᥈ା᣽ఋᎮ 载体ᖔ构建质粒 ା᧕᥋۪኏኏ጢܦା᧕᥋
处理 ԰࿗ ၤ 后ᖔ转移到光照培养间长日照条件下ྉ全 ۪኏኏Ꭾ 和 ା᧕᥋۪኏኏ँᖔ 并 构 建分段质粒 ା᧕᥋
天 ԰԰ ቩ ᖔ白光光照 ϟᤃ ၤᖔ黑暗 ऐၤɯ 培养 ऐʛ 左右ᖔ ۪኏኏ጢ ϟͱϟऐԡ ܦା᧕᥋۪኏኏ጢ ϟᎮ԰ͱጢጢऐ 和 ା᧕᥋۪኏኏ጢ ጢԡ԰ͱጢጢऐ ྉɟᑕႿ੫
移栽至湿润土壤中ᤥ 使用保鲜膜覆盖幼苗ᖔ放置 ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ ԰ԡ԰ϟɯᤥ 将花青素合成调控蛋白 ᥘɟାᎮጢܦ

在培养间长日照条件下ᖔ԰ ጲ ሕ ʛ 后揭膜继续培养ᤥ ᥘɟାँԡܦᥘɟାϟϟሕܦᥘɟାϟϟ࿗ 和 ఋఋऐ 的全长编码序