Page 47 - 《广西植物》2023年第7期
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７ 期 吴会会等: 丛枝菌根真菌和根瘤菌对白三叶氮同化的影响 １ ２ １ ５
(２０２０)的前期研究结果ꎬ选用 ＡＭＦ 菌种为隐类球 对湿度为 ６８％ꎮ 定期更换塑料盆位置以避免环境
囊霉(Ｐａｒａｇｌｏｍｕｓ ｏｃｃｕｌｔｕｍ)ꎬ由中国丛枝菌根真菌 差异影响试验结果ꎮ 植物培养期间未添加其他养
种质资源库( ＢＧＣ) 提供ꎻ经白三叶盆栽扩繁 ３ 个 分ꎬ每日 １７:００ 浇 水 １００ ｍＬꎬ 培 养 １２ 周 后 结 束
月后ꎬ由长江大学根系生物学研究所通过孢子密 试验ꎮ
度测定ꎬ确定每克 ＡＭＦ 菌种内含 ２０ 个孢子ꎮ 供试 １.４ 植株生长及生理指标测定
三叶草根瘤菌( Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｔｒｉｆｏｌｉｉ) 由中国农业微生 收获时植株分成地上部与地下部ꎬ人工测定
物菌种保藏管理中心提供ꎬ经酵母甘露醇液体培 生长指标ꎬ即植株株高、叶片数、匍匐茎长度和生
养基活化、单菌落培养ꎮ 挑取单菌落置于 ４０ ｍＬ 物量ꎮ 采用 ＦｌｕｏｒＣａｍ 叶绿素荧光成像仪进行活体
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液体培养基中ꎬ在 ２２０ ｒｍｉｎ 、２８ ℃ 下培养 １８ ｈꎮ 测定叶绿素荧光参数ꎮ
取 １ ｍＬ 菌液置于 ２０ ｍＬ 液体培养基中ꎬ在 ２２０ ｒ 根 系 菌 根 真 菌 侵 染 测 定 采 取 Ｐｈｉｌｌｉｐｓ 和
￣１ Ｈａｙｍａｎ(１９７０)的方法ꎬ菌根真菌侵染率为 ＡＭＦ 侵
ｍｉｎ 、２８ ℃ 下继续培养 ３ ｈꎬ随后 ８ ０００ ×ｇ 离心 ２
ｍｉｎꎬ弃上清液ꎬ用无菌水制菌悬液至浓度为 ４.２７× 染的根段长度与观察的总根段长度的百分比ꎮ 叶
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１０ ＣＦＵｍＬ (ＯＤ 为 ０.３)ꎮ 绿素含量测定采用王学奎(２０１６) 的方法ꎮ 叶片 Ｎ
６００
栽培基质为土和沙ꎬ比例为 ３ / １( Ｖ / Ｖ)ꎬ经过 含量测 定ꎬ 将 叶 片 消 化 后 采 用 间 断 化 学 分 析 仪
高温灭菌(０.１１ ＭＰａꎬ１２１ ℃ ꎬ２ ｈ)使沙和土中的土 (Ａｕｔｏｃｈｅｍ １２００) 分析ꎮ 叶片氨基酸组分经过乙
著真菌孢子失活ꎮ 试验用土采自长江大学落叶果 腈 水 超 声 提 取、 离 心 和 微 孔 滤 膜 过 滤
树基地ꎬ试验用沙为直径< ４ ｍｍ 的河沙ꎮ 试验用 (Ｌｉｙａｎａａｒａｃｈｉｃｈｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)ꎬ之后在高效液相色
塑料盆的规格为上口径 １５ ｃｍ、下口径 １０ ｃｍ、高 谱－ 质 谱 联 用 ( Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ￣２０ＡＤＸＲ 和 Ａｐｐｌｉｅｄ
１２ ｃｍꎬ装 １.３ ｋｇ 基质ꎮ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｃｉｅｘ Ｑ￣ｔｒａｐ ５５００ 质谱仪)上分析ꎮ
１.２ 试验设计 叶片硝酸还原酶活性测 定 采 用 磺 胺 比 色 法
共 设 置 ４ 个 处 理ꎬ 分 别 为 未 接 种 对 照 ( Ｃｅｒｖｉｌｌａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００９)ꎮ 亚硝酸还原酶活性测定参
(ｃｏｎｔｒｏｌ)、接种根瘤菌( ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｒｈ)、接种 照 Ｏｇａｗａ 等(１９９９)的方法ꎮ 谷氨酸合成酶测定依
ＡＭＦ(ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＡＭＦ)、联合接种 ＡＭＦ 和根 据 Ｓｉｎｇｈ 和 Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ(１９８６) 的方法ꎮ 采用刘淑云
瘤菌(ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＡＭＦ ａｎｄ Ｒｈ)ꎮ 每个处理有 等(２００７)的方法测定谷氨酸脱氢酶活性ꎮ 天冬酰
８ 个重复ꎬ随机排列ꎬ共 ３２ 盆ꎮ 胺合成酶活性测定参照 Ｓｈｉｆｒｉｎ 等(１９７４) 的方法ꎮ
１.３ 植物培养 丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶活性测定依据梁
在将白三叶播种前ꎬ用 ９５％乙醇和 ０.５２５％次 成刚等(２０１３)的方法ꎮ 谷氨酰胺合成酶测定参照
氯酸钠分别对种子进行表面消毒 ５ ｍｉｎꎬ用无菌水 Ｈｕｓｔｅｄ 等(２００２)的方法稍作修改ꎬ即称取 ０.２ ｇ 新
清洗 ５ 次ꎬ之后按照 ３０ 粒种子 / 盆ꎬ播种在装有栽 鲜样品ꎬ加入 ３ ｍＬ ５０ ｍｍｏｌＬ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ 缓冲液
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培基质的塑料盆中ꎬ３ 周后间苗至 １２ 棵 / 盆ꎮ 播种 (０.１ ｍｏｌＬ Ｔｒｉｓ、２ ｍｍｏｌＬ ＭｇＳＯ 、２ ｍｍｏｌ
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的时候进行接种处理ꎬ其中单接种根瘤菌处理是 Ｌ 二硫苏糖醇和 ４０ ｍｍｏｌＬ 蔗糖) 研磨成浆ꎬ４
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每盆接种 １０ ｍＬ 三叶草根瘤菌菌悬液ꎬ并且所播 ℃ 下１０ ０００ ×ｇ离心 １５ ｍｉｎꎻ取 ０.７ ｍＬ 上清液ꎬ加
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种子预先在三叶草根瘤菌菌悬液浸泡 ３０ ｍｉｎꎻ单 入 １.６ ｍＬ 反应液(８０ ｍｍｏｌＬ ＭｇＳＯ 、２０ ｍｍｏｌ
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接种 ＡＭＦ 处理是将 １００ ｇ 隐类球囊霉菌种混于栽 Ｌ Ｌ￣Ｎａ￣谷氨酸盐和 ２０ ｍｍｏｌＬ Ｌ￣半胱氨酸) 以
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培基质中ꎻ联合接种 ＡＭＦ 和根瘤菌处理是将 １００ ｇ 及 ０.７ ｍＬ ＡＴＰ 溶液ꎬ混匀后置于 ３７ ℃ 下保温 ３０
隐类球囊霉菌种混于栽培基质ꎬ并且所播种子预 ｍｉｎꎬ加入 １ ｍＬ 显色剂( ０. ２ ｍｏｌＬ 三氯乙 酸、
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先在三叶草根瘤菌菌悬液浸泡 ３０ ｍｉｎꎬ之后将 １０ ０.３７ ｍｏｌＬ ＦｅＣｌ 和 ０.６ ｍｏｌＬ ＨＣｌ)ꎬ摇匀ꎬ显
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ｍＬ 三叶草根瘤菌菌悬液接种到栽培基质中ꎻ未接 色 １０ ｍｉｎ 后ꎬ于 ５ ０００ ×ｇ 离心 １０ ｍｉｎ 后取其上清
种对照是混入等量灭菌的隐类球囊霉菌种和三叶 液ꎬ在 ５４０ ｎｍ 下测定吸光值ꎮ
草根瘤菌菌悬液ꎬ并且种子同样浸泡在灭菌后的 １.５ 数据统计分析
三叶草根瘤菌菌悬液中 ３０ ｍｉｎꎮ 处理后的植物生 使用 ＳＡＳ 软件(９. １. ３ｖ) ( ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ.ꎬ
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长在一个环境可控的生长室内培养ꎬ光照强度为 Ｃａｒｙꎬ ＮＣꎬ ＵＳＡ) 进行方差分析ꎬ采用邓肯新复极
９００ ｌｘꎬ温度为 ２８ ℃ / ２３ ℃ ( 白天 / 黑夜)ꎬ空气相 差法进行多重比较ꎮ
