Page 40 - 《广西植物》2025年第2期
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２ ４ ２ 广 西 植 物 ４５ 卷
生长 １ ~ ２ 个月的叶片定为新叶( ｎｅｗ ｌｅａｆꎬ ＮＥＷ)ꎬ 定量分析则通过使用三 重 四 极 杆 质 谱 仪 的
生长 １ 年半周期的叶片定为老叶(ｏｌｄ ｌｅａｆꎬ ＯＬＤ)ꎮ ＭＲＭ 模式完成ꎬ这一步骤通过三重四极杆筛选出
四数九里香种子采自广西壮族自治区大化瑶族自 每种物质的特征离子ꎬ并在检测器中测量这些离
治县都阳林场(１０７.６５６ ５７° Ｅ、２３.９７４ １８２° Ｎ)ꎬ培 子的信号强度ꎮ 使用 ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ 软件处理质谱数
养于湖南省长沙市中南林业科技大学校园温室ꎮ 据文件ꎬ对色谱峰进行积分和校正ꎬ其中每个色谱
取样后立即置于液氮中速冻 ２ ｈ 后在－８０ ℃ 超低 峰的面积代表了相应物质的相对含量ꎮ 通过对所
温冰箱中暂存用于后续试验ꎮ 有样本的代谢物质谱峰面积进行积分ꎬ并对不同
１.２ 研究方法 样本中相同代谢物的峰面积进行校正ꎬ得到准确
１.２.１ 样品制备 将四数九里香叶片放置于冻干 的代谢物质量分析数据ꎮ
机(Ｓｃｉｅｎｔｚ￣１００Ｆ)中进行真空冷冻干燥ꎻ利用研磨 １.３ 差异积累代谢物筛选
仪(ＭＭ４００ꎬ Ｒｅｔｓｃｈ)将样品研磨(３０ Ｈｚꎬ １.５ ｍｉｎ) 通过质控样本 ＱＣ 质谱检测分析代谢物的提
至粉末状ꎻ称取 １００ ｍｇ 的样品粉末ꎬ溶解于 １. ２ 取和检 测 的 重 复 性ꎬ 采 用 主 成 分 分 析 ( ｐｒｉｎｃｉｐａｌ
ｍＬ ７０％甲醇提取液中ꎻ每 ３０ ｍｉｎ 涡旋 １ 次ꎬ每次 ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓꎬＰＣＡ)和正交偏最小二乘法－判
持续 ３０ ｓꎬ共涡旋 ６ 次ꎬ之后将样本置于 ４ ℃ 冰箱 别分析法(ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｐａｒｔｉａｌ ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅ￣ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ
过夜ꎻ离心(１２ ０００ ｒｍｉｎ ꎬ １０ ｍｉｎ)后ꎬ吸取上清 ａｎａｌｙｓｉｓꎬＯＰＬＳ￣ＤＡ)进行代谢物组间差异分析ꎮ 使
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液ꎬ用微孔滤膜(０.２２ μｍ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ) 过滤样品ꎬ并 用代谢物变量重要性投影(ＶＩＰ) ≥１ꎬ折叠变化率
保存于进样瓶中ꎬ用于 ＵＰＬＣ￣ＭＳ / ＭＳ 分析ꎮ (ＦＣ) ≥１ꎬＰ<０.０５ 作为筛选条件ꎬ并使用 ＫＥＧＧ
１.２.２ ＵＰＬＣ￣ＭＳ / ＭＳ 条件 液相条件:数据分析使 数据库对筛选的差异积累代谢物进行富集分析ꎮ
用 ＵＰＬＣ ( ＳＨＩＭＡＤＺＵ Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２) 进行色谱检测ꎬ １.４ 差异积累代谢物验证
色谱 柱 为 ＡｇｉｌｅｎｔＳＢ￣Ｃ ꎬ ２. １ ｍｍ × １００ ｍｍꎬ １. ８ １.４.１ 样品溶液的制备 精密称取 ０.５ ｇ 烘干的四
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μｍꎬ柱温 ４０ ℃ ꎻ以流动相 Ａ 和 Ｂ 进行梯度洗脱ꎮ 数九里香叶片ꎬ液氮研磨成粉末ꎬ加 ２０ ｍＬ ７５％甲
流动相:Ａ 相为超纯水加入 ０.１％的甲酸ꎬＢ 相为乙 醇ꎬ超声提取(２００ Ｗ、５５ ℃ ) ３０ ｍｉｎꎬ过滤ꎬ重复 ２
腈加入 ０.１％的甲酸ꎻ柱平衡后ꎬ每个样品进样量 次ꎬ合并滤液ꎬ置 ５０ ｍＬ 量瓶中ꎬ用甲醇定容ꎬ取上
为 ４ μＬꎮ 洗脱梯度:０.００ ｍｉｎ 时 Ｂ 相比例为 ５％ꎬ 清液ꎬ过 ０.２２ μｍ 滤膜ꎬ即得待测样品溶液ꎮ
９.００ ｍｉｎ Ｂ 相 比 例 线 性 增 加 到 ９５％ꎬ 并 维 持 在 １.４.２ ＨＰＬＣ 色谱条件 参考程慧林等(２０２２)的实
９５％ １ ｍｉｎꎬ１０.００ ~ １１.１０ ｍｉｎꎬＢ 相比例降为 ５％ꎬ 验条 件ꎬ 采 用 Ｗａｔｅｒｓ ＯＤＳ Ｃ 柱 ( ４. ６ ｍｍ × ２５０
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￣１ ｍｍꎬ５ μｍ)ꎬ流动相为色谱乙腈( 溶液 Ａ) 和含有
并以 ５％平衡至 １４ ｍｉｎꎻ流速为 ０.３５ ｍＬｍｉｎ ꎮ
质谱条件:使用配备 ＥＳＩ￣Ｔｕｒｂｏ 离子喷雾接口 ０.１％甲酸的超纯水(溶液 Ｂ)ꎬ进行线性梯度洗脱ꎬ
的 ＭＳ 系 统 ( Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４５００ ＱＴＲＡＰ ) 对 检测波长为 ２８０ ｎｍꎻ柱温 ２５ ℃ ꎻ进样量 １０ μＬꎻ流
ＵＰＬＣ 流出物进行分析ꎬ操作参数如下:ＥＳＩ 源温度 速 １ ｍＬｍｉｎ ꎮ 采用购自北京索莱宝科技有限公
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５５０ ℃ꎬ正离子喷雾电压 ５.５ ｋＶꎬ负离子喷雾电压 司的标准品对香豆酸、柚皮苷查尔酮、异槲皮苷用
４.５ ｋＶꎬ帘气 ２５ ｐｓｉꎬ碰撞激活解离装置 ５ ｐｉｓꎮ 三重 甲醇将其分别配制成 ２ ｍｍｏｌＬ 的母液ꎬ进行梯
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四级杆扫描是作为多反应监测 ( ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ 度稀释ꎬ以进样量( μＬ) 为横坐标ꎬ峰面积为纵坐
ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇꎬ ＭＲＭ) 实验获得的ꎬ 针对每 个 单 独 的 标ꎬ进行线性回归ꎬ制作标准曲线ꎮ 对香豆酸、柚
ＭＲＭ 转变ꎬ具有优化的去簇电位和碰撞能量 ＣＥꎮ 皮苷 查 尔 酮、 异 槲 皮 苷 的 回 归 方 程 分 别 为 Ｙ ＝
１.２.３ 代 谢 物 定 性 定 量 分 析 基 于 自 建 数 据 库 １４.７５２Ｘ＋２３.０１５( ｒ ＝ ０.９９９ ２)、Ｙ ＝ ３０.１５Ｘ－０.０８４
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ＭＷＤＢ (ｍｅｔｗａｒｅ ｄａｔａｂａｓｅ)ꎬ根据二级谱信息进行 (ｒ ＝ ０.９９９ ６)、Ｙ ＝ ４８.６７Ｘ－２.３１５(ｒ ＝ ０.９９９ ５)ꎮ
２
２
物质定性ꎬ分析时去除同位素信号ꎬ使用 Ａｎａｌｙｓｔ
１.６.３ 软件处理质谱数据ꎮ 这个过程涵盖了基于 ２ 结果与分析
二级质谱信息的物质鉴定ꎬ并排除了同位素信号、
含有 Ｋ 、Ｎａ 、ＮＨ 离子的信号ꎬ以及源自更大分 ２.１ 代谢组 ＰＣＡ 和 ＯＰＬＳ￣ＤＡ 分析
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子的碎片离子的重复信号ꎮ 基于 ＵＰＬＣ￣ＭＳ / ＭＳ 检测平台、 北京百迈客生
