Page 50 - 《广西植物》2020年第12期
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ϟ 期 张 花 等 ᧥ 盐穗木病程相关蛋白 ̀ዹ۪ϟԡ 抗血清的制备及鉴定 ϟ Ꭾ ሕ ጢ
核诱导表达的最佳条件ᤥ 在最佳诱导条件下表达 清 ሕᎮ ቩ 孵育 ၤᖔ࿗ ቩ 过夜ᖔጢ ԡԡԡ ʢኼቝᔽႿ ᖔ离心
᥋ϟ
重组蛋白 ̀ᔽ༁᥋̀ዹ۪ϟԡᖔ收集菌体ᖔ超声破碎ᖔऐ ԡԡԡ ϟጢ ቝᔽႿ 分离血清ᖔ于ͱऐԡ ቩ 保存ᤥ
᥋ϟ
ʢኼቝᔽႿ ᖔ离心 ϟԡ ቝᔽႿ 收集上清ᖔ上镍柱纯化蛋白ᖔ ϟ࿗ 多克隆抗体的效价检测 জ 以纯化的 ̀ᔽ༁᥋
然后用 ԡԡ ቝቝᆍኼᓂ 的咪唑洗脱ᖔ୩᧕୩᥋۪ዶ᥈ጶ 检 ̀ዹ۪ϟԡ 融合蛋白为抗原每孔加 ϟဂ੫ 包被 ጶᓂ᧧୩ዶ
᥋ϟ
测洗脱蛋白ᖔ用索莱宝公司 ାऊዶ 蛋白定量试剂盒 板ᖔ࿗ ቩ 过夜ᖔ用 ఋఋା୩ 洗涤 ሕ 次ᖔ每次 ϟԡ ቝᔽႿᖔ用
ԡԡ ဂᓂ ϟᠮ ା୩ዶ 封闭液 ሕᎮ ቩ 封闭 ϟၤᤥ 先加入用
进行定量ᖔ分装置于ͱऐԡ ቩ 冰箱保存ᤥ
ϟᠮ ା୩ዶ 封闭液梯度稀释的免疫前和免疫后血清
表 ϓই ଧᒦԣϓᡓጛ௴ԣࣽᐹ̵ዞۗቴϓԔ 诱导表达因素水平表 ྉ每孔 ϟԡԡ ဂᓂɯᖔሕᎮ ቩ 孵育 ϟၤᖔ用 ఋఋା୩ 洗涤 ሕ 次ᖔ
ఋᑕᤦᔀ ϟজ ఋᑕᤦᔀ ᆍ ᔀᡱʢᔀ༁༁ᔽᆍႿ ᑕዹᡷᆍʢ ᔀᔀ ᆍʢ 每次 ሕቝᔽႿᖔ再加入 ϟ ᨒ ϟ ԡԡԡ 的 ۪̀ 标记的山羊
ାᓂϟ᥋ᡱጶఋऐᑕ᥋̵ዞۗቴϟԡ
抗小鼠 ᧧᥈੫ 二抗ᖔሕᎮ ቩ 孵育 ϟၤᖔ用 ఋఋା୩ 洗涤 ࿗
因素 èᑕዹᡷᆍʢ 次ᖔ每次 ሕቝᔽႿᖔ最后以 ఋᥘା 为底物进行显色ᖔ待呈
᥋ϟ
现梯度蓝色后每孔加入 ጢԡ ဂᓂ ቝᆍኼᓂ 的 ̀ ୩ᨃ
水平 ዶ ା ऊ ᧕ ࿗
ᓂᔀᔀ ᧧۪ఋ᥈ 浓度 温度 转速 时间 终止反应ᖔ检测 ࿗ጢԡ Ⴟቝ 波长下的吸光度ᤥ 免疫前
ऊᆍႿዹᔀႿᡷʢᑕᡷᔽᆍႿ ఋᔀቝᡱᔀ᥋
୩ᡱᔀᔀʛ ఋᔽቝᔀ
ᆍ ᧧۪ఋ᥈ ʢᑕᡷࣼʢᔀ 血清为对照ᖔ免疫前后 ዶ 值分别为 શ 和 ۪ᖔ以
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ྉʢኼቝᔽႿ ɯ ྉၤɯ ࿗ጢԡ
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ྉቝቝᆍኼᓂ ɯ ྉቩ ɯ
۪ᣰશᢦϟ 为标准判断血清有效效价ᤥ
ϟ ԡ ࿗ Ꭾ ϟ ऐ ԡ ࿗
ϟጢ ۼᔀ༁ᡷᔀʢႿ ାᆍᡷᡷᔽႿ੫ 检测জ 以营养土中生长 ࿗ 周
ԡ Ꭾ ሕ ϟ ԡ ԡ ጢ
龄的拟南芥为材料ᖔ按照 ᆍᡷᔀᢃᔀᑕ ᔀᡷ ᑕྉԡϟϟɯ 所
ሕ ԡ ऐ ሕ Ꭾ ԡ ᤃ
述的方法提取植物总蛋白ᖔ用 ାʢᑕʛᆍʢʛ 蛋白浓度测
定 试剂盒进行蛋白定量ᤥ 分别取 ϟԡ ဂ੫ ̀ᔽ༁᥋
表 ԣই ଧᒦԣϓᡓጛ௴ԣࣽᐹ̵ዞۗቴϓԔ 诱导表达的正交分析表
̀ዹ۪ϟԡ 重组蛋白和 ϟԡ ဂ੫ 拟南芥植株总蛋白ᖔ经
ఋᑕᤦᔀ জ ᨃʢᡷၤᆍ੫ᆍႿᑕ ᑕႿᑕᢃ༁ᔽ༁ ᆍ ዹᆍႿʛᔽᡷᔽᆍႿ༁ ᆍ ᡱʢᆍҴᑕʢᢃᆍᡷᔽዹ
ϟጢᠮ ୩᧕୩᥋۪ዶ᥈ጶ 分离后转印至 શऊ 膜上ᖔ用含 ጢᠮ
ᔀᡱʢᔀ༁༁ᔽᆍႿ ᆍʢ ାᓂϟ᥋ᡱጶఋऐᑕ᥋̵ዞۗቴϟԡ
脱脂奶粉的 ۪ା୩ఋ ࿗ ቩ 过夜封闭ᖔ用 ϟ ᨒ ϟ ጢԡԡྉ ᣰ
᧧۪ఋ᥈ 浓度 转速
组别 ऊᆍႿዹᔀႿᡷʢᑕᡷᔽᆍႿ 温度 时间 ɯ一抗ᖔሕᎮ ቩ 孵育 ၤᖔ۪ା୩ఋ 洗膜 ሕ 次ᖔ每次 ϟԡ
ఋᔀቝᡱᔀʢᑕᡷࣼʢᔀ ୩ᡱᔀᔀʛ ఋᔽቝᔀ
᥈ʢᆍࣼᡱ ᆍ ᧧۪ఋ᥈ ᥋ϟ
᥋ϟ ྉቩ ɯ ྉʢኼቝᔽႿ ɯ ྉၤɯ ቝᔽႿଫ加入 ϟ ᨒ ԡԡԡྉ ᣰ ɯ 的辣根过氧化物酶标记
ྉቝቝᆍኼᓂ ɯ
ϟ ϟྉԡ࿗ɯ ϟྉᎮɯ ϟྉϟऐԡɯ ϟྉ࿗ɯ 的山羊抗小鼠 ᧧੫᥈ᖔሕᎮ ቩ 孵育 ၤᖔ۪ା୩ఋ 洗涤 ሕ 次ᖔ
ϟྉԡ࿗ɯ ྉሕϟɯ ྉԡԡɯ ྉጢɯ
每次 ϟԡ ቝᔽႿᖔ洗涤后 ᧕ዶା 显色ᤥ
ሕ ϟྉԡ࿗ɯ ሕྉሕᎮɯ ሕྉԡɯ ሕྉᤃɯ
࿗ ྉԡᎮɯ ϟྉᎮɯ ྉԡԡɯ ሕྉᤃɯ
জ 结果与分析
ጢ ྉԡᎮɯ ྉሕϟɯ ሕྉԡɯ ϟྉ࿗ɯ
ᤃ ྉԡᎮɯ ሕྉሕᎮɯ ϟྉϟऐԡɯ ྉጢɯ
ԣॹϓ 原核表达载体 ᡓጛ௴ԣࣽᐹ̵ዞۗቴϓԔ 的构建及鉴定
Ꭾ ሕྉԡऐɯ ϟྉᎮɯ ሕྉԡɯ ྉጢɯ
提取构建获得的重组质粒 ᡱጶఋऐᑕ᥋̵ዞۗቴϟԡᖔ采
ऐ ሕྉԡऐɯ ྉሕϟɯ ϟྉϟऐԡɯ ሕྉᤃɯ
ँ ሕྉԡऐɯ ሕྉሕᎮɯ ྉԡԡɯ ϟྉ࿗ɯ
用 ጛዞᅳ ሙ和 ̵ᔠႥʐ ᎏ进行双酶切鉴定ᖔ经 ϟᠮ琼脂
糖凝胶电泳获得了与预期 ࿗ऐᤃ ᤦᡱ 大小相符的目的
ϟሕ 抗血清的制备জ 以纯化的 ̀ᔽ༁᥋̀ዹ۪ϟԡ 融合 基因片段和载体片段ྉ 图 ϟɯᖔ测序结果正确ᖔ表明
蛋白为抗原ᖔ采集免疫前 ାዶᓂା ᣰ ዹ 小鼠血清为阴性 原核表达载体 ᡱጶఋऐᑕ̵ዞۗቴϟԡ 构建成功ᤥ
对照ᤥ 取 ጢԡ ဂ੫ 抗原与等体积弗氏完全佐剂乳化ᖔ ԣॹԣ 重组蛋白 ̵ዞۗቴϓԔ 的原核表达条件优化及
采用腹腔注射法对小鼠进行初次免疫ᖔ并分别在 纯化
第 ϟԡ 天ܦ第 ँ 天ܦ第 ሕሕ 天用等体积弗氏不完全佐 ϟ 重组蛋白 ̀ዹ۪ϟԡ 的原核表达জ 将重组质粒
剂乳化的目的蛋白加强免疫ᖔ每只 ጢԡ ဂ੫ 剂量ᤥ 第 ᡱጶఋऐᑕ᥋̵ዞۗቴϟԡ 转化到大肠杆菌 ାᓂϟ 中ᖔ随机挑
࿗ 次免疫 ࿗ʛ 后采用眼部取血法采血ᖔ将收集的血 取 ࿗ 个 ାᓂϟ᥋ᡱጶఋऐᑕ᥋̵ዞۗቴϟԡ 单克隆ᖔ 在 ԡᎮ
