Page 120 - 《广西植物》2020年第6期

８ ６ ６ 广 西 植 物 ４０ 卷
林和工业用材树种ꎮ 松木广泛应用于建筑、枕木、 预 测 ＯＲＦꎻ 利 用 在 线 软 件 Ｅｘｐａｓｙ Ｐｒｏｔｐａｒｍａ 和
矿柱、家具及制浆造纸等ꎬ从树干可割取松脂ꎬ为 ＰｒｏｔＳｃａｌｅ 分析候选基因编码蛋白的理化性质ꎬ包
医药和化工原料ꎬ从树皮可提取栲胶ꎬ根部可用来 括蛋白质分子量、理论等电点、氨基酸组成以及疏
培养茯苓等蕈类ꎬ系名贵滋补中药材ꎮ 细胞分裂 水性ꎻ使用 ＴＭＨＭＭ ｖ.２.０ Ｓｅｒｖｅｒ、ＳｉｇｎａｌＰ ４.１ Ｓｅｒｖｅｒ
素羟化酶 ＣＹＰ７３５Ａ 属于细胞色素 Ｐ４５０ 单加氧酶 和 Ｃｅｌｌ￣Ｐｌｏｃ ２.０ 工具进行目的蛋白跨膜区、信号肽
家族成员ꎬ它通过羟基化作用调控植物体内 ｔＺ 的 和亚细胞定位预测ꎻ通过 Ｐｆａｍ 数据库预测候选基
含量水平ꎬ在植物茎的生长发育过程中扮演关键 因编码蛋白质的保守结构域ꎬ并借助 ＳＯＰＭＡ 和

角色(Ｋｉｂａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３ꎻＣａｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)ꎮ 在林木 Ｓｗｉｓｓ￣Ｍｏｄｅｌ 软件预测蛋白质的高级结构ꎮ
树种中ꎬ鲜有细胞分裂素羟化酶基因克隆和鉴定的 １.４ 系统进化树构建
相关报道ꎮ 本研究首次在针叶树种马尾松中克隆 不同物种的氨基酸序列使用 ＤＮＡＭＡＮ 软件
和鉴定了细胞分裂素羟化酶(ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｍｏｎｏｏ￣ 进行多重比对ꎬ使用 ＭｅｇａＸ 软件并采用邻接法构
ｘｙｇｅｎａｓｅꎬｆａｍｉｌｙ ７３５ꎬｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ａ)基因 ＣＹＰ７３５Ａꎬ以期 建系统进化树ꎮ
进一步展开 ＣＹＰ７３５Ａ 基因家族的生物学功能研究 １.５ 实时定量 ＰＣＲ

及其在不同物种间的表达调控异同ꎮ 将 前 述 样 品 的 总 ＲＮＡ 经 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＴＭ ＲＴ
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ( ＴａＫａＲａꎬ大连) 反转录合成 ｃＤＮＡꎮ 在
１ 材料与方法 ＶｉｉＡ ＴＭ ７ 平 台ꎬ 使 用 不 饱 和 荧 光 染 料 ＦａｓｔＳｔａｒｔ

Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ(ＲＯＸ) 开展候选基因
１.１ 植物材料及 ＲＮＡ 提取 实时定量 ＰＣＲ 检测ꎬ反应体系和反映程序参照其
植物材料为光照培养箱条件下的马尾松实生 说明书ꎮ 每个样品均进行三次技术重复ꎬ以 ＵＢＩ４
苗ꎮ 用 ５ μｍｏｌＬ 浓度的 ＮＡＡ 溶液浇灌马尾松 基因(Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６)为内参基因ꎬ基于 ２ －ΔΔＣｔ 算
￣１
幼苗(５ 周苗龄)ꎬ分别于 ０(ＣＫ)、１ 、２ 、４、８ ｈ 五个 法进行目的基因在 ＮＡＡ 处理不同时间的不同组
时间点取其根、茎和叶组织样本ꎬ经液氮速冻后于 织中的相对表达分析ꎮ

－８０ ℃ 保存ꎮ 使用 ＲＮＡｐｒｅ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔ(Ｐｏｌｙｓａｃ￣
ｃｈａｒｉｄｅｓ ＆ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｉｃｓ￣ｒｉｃｈ)(ＴＩＡＮＧＥＮꎬ北京) 提 ２ 结果与分析

ＴＭ ２０００ 紫外
取上述植物材料总 ＲＮＡꎬ经 ＮａｎｏＤｒｏｐ
分光光度计测定总 ＲＮＡ 浓度ꎬ并使用琼脂糖凝胶 ２.１ 马尾松 ＰｍＣＹＰ７３５Ａ 基因克隆及序列分析
电泳检测 ＲＮＡ 完整性ꎮ 通过 ＮＣＢＩ 数据库比对结果显示ꎬ目的基因所
１.２ 基因克隆 编码蛋白质具备 Ｐ４５０ 结构域ꎬ且与其他物种细胞
根据已获得的目的基因片段序列设计 ＲＡＣＥ 分裂素羟化酶同源性较高ꎮ 将该基因编码氨基酸
特异引物(表 １)ꎬ以未处理的马尾松幼苗 ＲＮＡ 为 序列与拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ)细胞色素 Ｐ４５０
ＴＭ
模 板ꎬ 参 照 ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ 家族所有成员进行 ＢＬＡＳＴ 比对和系统进化分析ꎬ
Ｋｉｔ 操作指南进行目的基因 ３′￣ＲＡＣＥ 和 ５′￣ＲＡＣＥ 发现该预测蛋白质与拟南芥 ＣＹＰ７３５Ａ 家族关系
巢式 ＰＣＲ 扩增ꎬ并经产物回收、连接、转化、序列测 最为接近ꎮ 由于之前尚未有 ＣＹＰ７３５Ａ 基因亚家族

定、拼接、开放阅读框( ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅꎬＯＲＦ) 预 在针叶树种中克隆和验证的报道ꎬ因此将该基因
测及 测 序 验 证ꎬ 最 终 获 得 目 的 基 因 ｃＤＮＡ 全 长 命 名 为 ＰｍＣＹＰ７３５Ａꎮ 马 尾 松 ＰｍＣＹＰ７３５Ａ 基 因
序列ꎮ ｃＤＮＡ 全长为 １ ７４４ ｂｐꎬ其中包括 １ ６４７ ｂｐ 的 ＯＲＦ
１.３ 序列分析 区域、４４ ｂｐ 的 ５′端非翻译区(５′￣ＵＴＲ) 和 ５３ ｂｐ 的
使用 ＢｉｏＥｄｉｔ 软件对 候 选 基 因 片 段、３′ＲＡＣＥ ３′端非翻译区(３′￣ＵＴＲ)ꎮ 该基因序列在 ４５ ~ ４７ 位
和 ５′ＲＡＣＥ 序列进行比对拼接ꎬ基于获取的候选基 为起始 密 码 子 ＡＴＧꎬ 下 游 存 在 同 框 终 止 密 码 子
因 ｃＤＮＡ 全长序列ꎬ利用在线分析工具 ＦＧＥＮＥＳＨ ＴＡＧ 和 ｐｌｏｙＡ 尾(图 １)ꎻ 可编码 ５４８ 个氨基酸ꎬ 其