Page 94 - 《广西植物》2023年第1期
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９ ０ 广 西 植 物 ４３ 卷
条叶斑病菌( Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ)、柑橘树脂病 获得的发酵滤液依次用 ０.４５、０.２２ μｍ 滤膜过滤ꎬ
菌 ( Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｃｉｔｒｉ )、 三 七 根 腐 病 菌 ( Ｆｕｓａｒｉｕｍ 获得无菌发酵滤液ꎬ保存于 ４ ℃ 冰箱备用ꎮ
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ)、茄病镰刀菌(Ｆ. ｓｏｌａｎｉ)、叶点霉菌为指 １.２.３ 供试菌株抗氧化活性测定 ＤＰＰＨ 清除能力
示菌( Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ ｚｉｎｇｉｂｅｒｉ)ꎬ评价内生真菌的抑菌 和总还原力是评价抗氧化活性的重要指标ꎬ参照
效果ꎬ并通过测定内生真菌发酵液 ＤＰＰＨ 清除自 前人 的 研 究 方 法 ( 宋 新 月 等ꎬ ２０１８ꎻ 金 宏 杰 等ꎬ
由基能力和总还原能力等指标ꎬ评价其抗氧化活 ２０１９)对 １.２.２ 中的无菌发酵滤液进行 ＤＰＰＨ 清除
性ꎬ为下一步从高活性菌株中筛选活性化合物奠 能力和总还原力测定ꎮ
定基础ꎬ也为民族用药黄花倒水莲资源的综合利 １.２.４ ＨＮＬＦ￣４４ 菌株的鉴定 采用透明胶带法在
用提供了另一条途径ꎮ 莱卡显微镜下观察 ＨＮＬＦ￣４４ 菌株的菌丝体和孢子
形态ꎬ根据真菌形态对照相关资料对菌株进行初
１ 材料与方法 步鉴定ꎮ 分子鉴定则根据真菌 ＩＴＳ 序列的保守性
来进行ꎬ根据真菌 ＤＮＡ 提取试剂盒说明书提取内
１.１ 材料 生真菌 ＨＮＬＦ￣４４ 的总 ＤＮＡꎬ以引物 ＩＴＳ１( 序列为
１.１.１ 供试菌株 供试 ２１ 株黄花倒水莲内生真 ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ) 和引物 ＩＴＳ４( 序列为
菌:实验室前期于 ２０２０ 年 ８—１１ 月从广西灵川、湖 ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ) 进 行 ＰＣＲ 扩 增ꎬ 用
南永州、云南文山等地采集的野生黄花倒水莲植 １.５％的琼脂糖凝胶电泳检测 ＰＣＲ 产物的纯度ꎬ将
株中分离得到ꎮ ＰＣＲ 产物送到上海生物工程有限公司进行测序ꎮ
供试 植 物 病 原 真 菌: 香 蕉 专 化 尖 孢 镰 刀 菌 对测序结果进行处理ꎬ然后将处理好的序列上传
(Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｕｂｅｎｓｅ)、 茄 病 镰 刀 菌 到 ＮＣＢＩ 数据库中进行 ＢＬＡＳＴ 比对ꎬ寻找与其相
(Ｆ. ｓｏｌａｎｉ)、三七根腐病菌(Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ)、香蕉具 似性最高的菌株序列ꎬ下载与其相似性最高的几
条 叶 斑 病 菌 ( Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ)、 叶 点 霉 菌 组序列作为参考序列ꎬ利用 ＭＥＧＡ７.０ 软件进行序
(Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ ｚｉｎｇｉｂｅｒｉ)、 柑 橘 树 脂 病 菌 ( Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ 列对齐、邻接法(ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ) 构建 ＨＮＬＦ￣４４ 菌
ｃｉｔｒｉ)ꎬ由广西大学农学院提供ꎮ 株的 系 统 发 育 树ꎬ 在 分 支 上 显 示 Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 重 复
１.１.２ 培养基 ＰＤＡ 培养基和 ＰＤＢ 培养基:购于 １ ０００次的数值ꎮ
北京暖溪汇智科技有限公司ꎬ前者 １００ ｍＬ 的培养
基中含有 ２ ｇ 马铃薯淀粉、０.６ ｇ 葡萄糖、２ ｇ 琼脂ꎻ ２ 结果与分析
后者 １００ ｍＬ 的培养基中含有 ２ ｇ 马铃薯淀粉、０.６
ｇ 葡萄糖ꎮ ２.１ 供试菌株抑菌活性初筛测定
１.２ 方法 黄花倒水莲供试菌株抑菌初筛结果如表 １ 所
１.２.１ 供试菌株抑菌活性测定 初筛和复筛过程 示ꎬ供试菌株对 ６ 种植物病原真菌具有不同程度
均采用平板对峙法(杨帆等ꎬ２０２１)ꎬ区别在于初筛 的拮抗作用(图 １)ꎮ 从抑制的病原菌来看ꎬＨＮＬＦ￣
过程采用五点对峙法ꎬ复筛过程采用两点对峙法ꎮ ７、ＨＮＬＦ￣２６、ＨＮＬＦ￣４４、ＹＮＬＦ￣３２ 对香蕉专 化 尖 孢
将对峙的 ＰＤＡ 平板在光照培养箱中静置培养 ５ ~ ７ 镰刀菌的抑制效果较强ꎬ其中 ＨＮＬＦ￣４４ 对香蕉专
ｄ 后ꎬ测量对照组菌落的半径( Ｒ) 和实验组病原真 化尖孢镰刀菌的抑制效果最好ꎬ抑菌率为 ６９.３％ꎮ
菌菌落朝内生真菌方向生长的半径( ｒ)ꎬ抑菌率取 除 ＨＮＬＦ￣９ 和 ＬＣＲＸＹ￣２６ 对柑橘树脂病菌的抑菌
３ 次重复的平均值ꎮ 抑菌率(％)＝ (Ｒ－ｒ) / Ｒ×１００ 率分别为 ４９.１％和 ４５.９％外ꎬ其余菌株的抑菌率均
１.２.２ 供试菌株液体发酵培养 将抑菌活性复筛 超过 ５０.８％ꎮ ＨＮＢＡ￣９ 对香蕉具条叶斑病菌抑制
的 １３ 株内生真菌在 ＰＤＡ 培养基上培养 ３ ~ ７ ｄ 效果最强ꎬ抑菌率为 ６９.１％ꎮ ＨＮＬＦ￣４４ 对三七根
后ꎬ用 ０.５ ｃｍ 的无菌打孔器在菌落边缘打取大小 腐病菌具有 ５８.９％ 的抑菌率ꎮ ＬＣＰＨ￣５ 对茄病镰
一致的菌块ꎬ在含有 １００ ｍＬ ＰＤＢ 液体培养基的 刀菌抑制效果最好ꎬ抑菌率为 ５９.０％ꎮ 所有供试
２５０ ｍＬ 锥形瓶中加入菌块 ３ 个ꎬ于 ２５ ℃ ꎬ１４０ ｒ 菌株均对叶点霉菌具有较强的抑菌效果ꎬ抑菌率均
￣１ 超过 ５３.６％ꎮ 综上表明ꎬＨＮＬＦ￣４４ 对 ６ 种植物病原
ｍｉｎ 的恒温摇床中进行培养 １５ ｄꎮ 培养结束后ꎬ
利用抽滤的方法将菌丝体和发酵液分开ꎬ然后将 真菌都具有较强的抑菌活性ꎬ抑菌率均超过 ５１.３％ꎮ
