Page 113 - 《广西植物》2023年第6期
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６ 期 彭凤等: ＯｓＩＭＡ１ 增强水稻对镉逆境的适应性 １ ０ ９ ９
磨仪打磨样品成粉末ꎮ 每个样品称取 ５００ ｍｇꎬ加
１ 材料与方法 入 ５ ｍＬ 硝酸于 １８５ ℃ 中消解 ３ ｈꎬ加入 ２ ｍＬ 高氯
酸 于 ２２０ ℃ 氧 化 ３０ ｍｉｎꎮ 利 用 美 国 Ｔｈｅｒｍｏ
１.１ 试验材料 ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ 公 司 的 电 联 耦 合 等 离 子 体 质 谱 仪
试验材料为粳稻品种“日本晴”ꎬ种植地点为云 (ＩＣＰ￣ＭＳ ｉＣＡＰ６３００)测定样品元素含量ꎮ
南省西双版纳傣族自治州勐腊县勐仑镇中国科学 １.５ 统计分析
院西双版纳热带植物园的作物保护与育种基地 所有试验数据均使用平均值±标准差(ｘ±ｓ) 表
(１０１°１９′ Ｅ、 ２１° ５２′ Ｎ)ꎮ 将 水 稻 种 子 用 双 蒸 水 示ꎮ 每个试验至少有 ３ 次生物学重复ꎮ 利用 ＳＰＳＳ
(ｄｄＨ Ｏ)浸泡 ２４ ｈ 后均匀地散布在吸水滤纸中ꎬ在 １７.０ 软件进行单因素方差分析( ｏｎｅ￣ｗａｙ ｖａｒｉａｎｃｅꎬ
２
２８ ℃人工温室黑暗放置 ３ ｄ 后ꎬ转移到 １ / ２ＭＳ 培养 ＡＮＯＶＡ) (Ｐ<０.０５)ꎮ
￣１
液中萌发生长 ７ ｄꎬ转移至不含 Ｃｄ 或含 ２５ μｍｏｌＬ
氯化镉(ＣｄＣｌ )的 １/ ２ＭＳ 水培液中培养 ７ ｄꎮ 每 ２ ｄ ２ 结果与分析
２
换 １ 次水培液ꎮ 生长光周期为光 １６ ｈ、暗 ８ ｈ 的循环ꎮ
１.２ 转基因植株的构建 ２.１ Ｃｄ 胁迫引起水稻 ＯｓＩＭＡ 基因表达上调
利用 ＣＲＩＳＰＲ￣ＧＥ( ｈｔｔｐ: / / ｓｋｌ.ｓｃａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ / ) 在 水稻基因组包含两个 ＯｓＩＭＡ 基因( ＯｓＩＭＡ１ 和
线设 计 ＯｓＩＭＡ１ 的 编 辑 靶 点ꎮ 通 过 Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＯｓＩＭＡ２)ꎮ 近来的研究表明 ＯｓＩＭＡ１ 和 ＯｓＩＭＡ２ 受到
ＰＣＲ 构建包含该靶点的 ｓｇＲＮＡꎬ并融合至 ＯｓＵ６ａ 缺 Ｆｅ 诱导(Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２１)ꎮ Ｃｄ 胁迫会严
启动子的下游ꎬ然后将 ＯｓＵ６ａ￣ｓｇＲＮＡ 克隆至携带 重限制植物的生长发育ꎬ从而导致植物表现出缺 Ｆｅ
Ｃａｓ９ 的 ｐＭＨ￣ＳＡ 载体( Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６)ꎮ 将表 症状ꎮ 为 研 究 Ｃｄ 胁 迫 是 否 能 影 响 ＯｓＩＭＡ１ 和
达载体转化至农杆菌 ＥＨＡ１０５ 菌株中用于水稻转 ＯｓＩＭＡ２ 的表达ꎬ对野生型(ｗｉｌｄ ｔｙｐｅꎬＷＴ) 水稻进行
化ꎬ并对转基因阳性苗进行 ＰＣＲ 测序ꎮ 对纯合植 Ｃｄ 处理后ꎬ检测了 ＯｓＩＭＡ１ 和 ＯｓＩＭＡ２ 的表达情况ꎮ
株进行扩繁ꎬ并进一步对 Ｔ３ 代植物在进行 ＰＣＲ 测 将在正常培养液上生长 ７ ｄ 的幼苗转移至不含 Ｃｄ
￣１
序ꎬ获得纯合突变植株ꎮ (Ｃｄ０)或含 ２５ μｍｏｌＬ ＣｄＣｌ (Ｃｄ２５) 的培养液中
２
用玉 米 Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ 启 动 子 驱 动 ＯｓＩＭＡ１ 全 长 生长 ７ ｄꎮ 提取根和地上部的 ＲＮＡ 并利用荧光定量
ＣＤＳꎬ获得 ＯｓＩＭＡ１ 过表达载体ꎮ 将构建的质粒转 ＰＣＲ 检测 ＯｓＩＭＡ１ 和 ＯｓＩＭＡ２ 的表达水平ꎮ 结果表
化至农杆菌 ＥＨＡ１０５ 菌株中用于水稻转化ꎮ 选用 明ꎬ在 Ｃｄ 胁 迫 条 件 下ꎬ 无 论 在 根 还 是 地 上 部ꎬ
含潮霉素抗性的转基因植株进行基因表达水平检 ＯｓＩＭＡ１ 和 ＯｓＩＭＡ２ 的表达均显著上调(图 １)ꎮ
测ꎬＴ３ 转基因植株用来试验分析ꎮ ２.２ ＯｓＩＭＡ１ 过表达植株对 Ｃｄ 耐受性更高
１.３ ｑＲＴ￣ＰＣＲ ＯｓＩＭＡ１ 和 ＯｓＩＭＡ２ 属于同源蛋白且二者在 Ｆｅ
利用水饱和酚法提取水稻根( ｒｏｏｔ) 或地上部 稳态方面的功能相近ꎮ 考虑到二者的转录水平均
(ｓｈｏｏｔ)的总 ＲＮＡꎮ 采用 ＲＴ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ (ｏｌｉｇｏ ｄＴ) 受到 Ｃｄ 处理诱导ꎬ本研究接下来以 ＯｓＩＭＡ１ 作为
和 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ ｆｏｒ ｑＰＣＲ ( 宝生物ꎬ 代表进行研究ꎮ 本研究利用玉米的 Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ 启动
日本) 试剂盒将 ＲＮＡ 反转录成 ｃＤＮＡꎬ随后使用 子驱动 ＯｓＩＭＡ１ 基因ꎬ并且转化了野生型水稻品种
ＴＭ ＲＴ 试剂( Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ) Ｋｉｔ ( 宝 “日本晴” ( 图 ２:Ａ)ꎮ 通过定量 ＰＣＲ 筛选获得了
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ
生物ꎬ日 本) 在 Ｌｉｇｈｔ￣Ｃｙｃｌｅｒ ４８０ 实 时 ＰＣＲ 仪 ( 罗 ＯｓＩＭＡ１ 的过表达转基因水稻植株ꎬ评 估 ＯｓＩＭＡ１
氏ꎬ瑞士) 上进行 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 检测ꎮ 每个基因的定 过表达植株对 Ｃｄ 胁迫的适应能力ꎮ 在正常水培
量 至 少 含 ３ 次 生 物 学 重 复ꎮ 以 ＯｓＡＣＴＩＮ１ 和 溶液生长一周的幼苗分别转移到不含 Ｃｄ ( Ｃｄ０)
￣１
ＯｓＯＢＰ 作为内参对照ꎬ对样品进行归一化处理ꎮ 或含 ２５ μｍｏｌＬ ＣｄＣｌ ( Ｃｄ２５) 的溶液再生长一
２
１.４ Ｆｅ 和 Ｃｄ 含量测定 周ꎬ观察和分析其表型ꎮ 结果表明ꎬ在 Ｃｄ０ 生长条
不同基因型的水稻材料于 １ / ２ＭＳ 营养液体萌 件下ꎬＯｓＩＭＡ１ 的过表达植株与野生型植株无明显
￣１ 区别ꎬ而在 Ｃｄ２５ 处理条件下ꎬ过表达植株的株高
发生长 ７ ｄ 后转移至不含 Ｃｄ 或含 ２５ μｍｏｌＬ
ＣｄＣｌ 的 １ / ２ＭＳ 水 培 液 培 养 ７ ｄꎮ 分 别 收 取 根 和 显著高 于 野 生 型 植 株 ( 图 ２: Ｂꎬ Ｃ)ꎮ 综 上 表 明ꎬ
２
叶ꎬ并置于 ６５ ℃ 烘箱干燥 ７ ｄꎮ 用高通量组织研 ＯｓＩＭＡ１ 过表达增强了植物对 Ｃｄ 胁迫的适应性ꎮ
