Page 134 - 《广西植物》2020年第1期
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１ ３ ０ 广 西 植 物 ４０ 卷
育不同时期的果皮( 花后 ３０、４２、５６、６７ 和 ７９ ｄ)ꎬ
采摘洗净后将果皮放入锡纸袋ꎬ液氮速冻带回实 ２ 结果与分析
验室ꎬ－８０ ℃ 冰箱中保存备用ꎮ
１.２ 荔枝果皮总 ＲＮＡ 提取和 ｃＤＮＡ 合成 ２.１ ＬｃＵＦＧＴ 基因的克隆
果皮总 ＲＮＡ 提取采用华越洋植物总 ＲＮＡ 提 经检 测ꎬ 从 果 皮 提 取 的 总 ＲＮＡ 质 量 较 好ꎬ
取试剂盒( 北京)ꎬ用 ＲＮＡ ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ( ＴａＫａＲａ) 消 Ａ２６０ / Ａ２８０ 比值在 １.８０ ~ ２.０ 之间ꎬ电泳检测条带
化 ＤＮＡ 残留ꎬ分别用 １.０％琼脂糖凝胶和全自动核 清晰无降解( 图 １)ꎮ 逆转录合成第一链 ｃＤＮＡ 用
酸蛋白分析仪检测 ＲＮＡ 纯度和浓度ꎬｃＤＮＡ 第一 于克隆 ＬｃＵＦＧＴ 基因ꎬ１.５％ 琼脂糖凝胶电泳检测
链的合成采用 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 的 ｃＤＮＡ 逆转录试剂盒ꎬ ＰＣＲ 扩增产物ꎬ可见一条清晰条带( 图 １)ꎬ纯化后
具体操作步骤按照试剂盒说明书进行ꎮ 连接到 ｐＭＤ２０￣Ｔ 载体ꎬ转化到 ＤＨ５α 大肠杆菌感
１.３ ＬｃＵＦＧＴ 基因的获得 受态细胞ꎬ通过蓝白斑筛选克隆测序ꎬ获得荔枝
根据 ＮＣＢＩ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ) 登 ＬｃＵＦＧＴ 基因序列信息(图 ２)ꎮ
入的 荔 枝 ＵＦＧＴ 基 因 序 列 信 息 ( ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ. ２.２ ＬｃＵＦＧＴ 基因的序列分析
ＨＱ４０２９１４)ꎬ用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５.０ 软件设计引物 荔枝 ＬｃＵＦＧＴ 同源基因 ＯＲＦ 长 １ ３５９ ｂｐꎬ编码
Ｐ１Ｕ 和 Ｐ１Ｌ( 表 １)ꎬ以合成的 ｃＤＮＡ 第一链为模 ４５３ 个氨基酸ꎬ用 ＥｘＰＡＳｙ ＰｒｏｔＰａｒａｍ 在线工具预测
板ꎬ用 ＥｘＴａｑ 酶(ＴａＫａＲａ)扩增ꎮ 具体 ＰＣＲ 反映体 ＬｃＵＦＧＴ 蛋白分子式为 Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ Ｓ ꎬ相对
２２６６ ３５４９ ６０７ ６４３ １８
系和扩增程序参照产品说明书ꎮ ＰＣＲ 产物检测纯 分子质量是 ５０ １６０.８７ꎬ等电点为 ７.７０ꎬ脂溶指数为
化后克隆到 ｐＭＤ２０￣Ｔ 载体ꎬ进行测序ꎮ ９１.０４ꎬ是脂溶性蛋白ꎬ不稳定指数为 ４４ ０５３ꎬ属于
１.４ ＬｃＵＦＧＴ 基因生物信息学分析 不稳定蛋白ꎬ亲水性指数为 － ０. ０６７ꎬ是疏水性蛋
ＮＣＢＩ ＯＲＦ ｆｉｎｄｅｒ (( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. 白ꎮ 用 Ｗｏｌｆ ＰＳＯＲＴ 在线工具预测 ＬｃＵＦＧＴ 蛋白定
ｎｉｈ.ｇｏｖ / ｇｏｒｆ/ )在线分析 ＬｃＵＦＧＴ 的开放阅读框ꎬ用 位在细胞质ꎮ ＳｉｇｎａｌＰ ４.１ Ｓｅｒｖｅｒ 在线预测表明该
ＥｘＰＡＳｙ ＰｒｏｔＰａｒａｍ 在 线 工 具 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ. 蛋白不存在信号肽ꎮ 用 ＴＭＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ ｖ. ２.０ 在线
ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ / ) 分析 ＬｃＵＦＧＴ 的理化性质ꎬ 工具预测其跨膜结构域ꎬ结果表明 ＬｃＵＦＧＴ 蛋白无
用 Ｗｏｌｆ ＰＳＯＲＴ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｏｌｆｐｓｏｒｔ. ｈｇｃ. ｊｐ / ) 在线预 跨膜区ꎮ 可以推测ꎬＬｃＵＦＧＴ 蛋 白 合 成 后 不 经 转
测 ＬｃＵＦＧＴ 蛋白的定位ꎮ 利用 ＳｉｇｎａｌＰ ４. １ Ｓｅｒｖｅｒ 运ꎬ在细胞质中行使催化功能ꎮ
(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＳｉｇｎａｌＰ / ) 进行信 在蛋白数据库中对 ＬｃＵＦＧＴ 序列进行 ｂｌａｓｔꎬ结
号 肽 分 析ꎮ 用 ＴＭＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ ｖ. ２. ０ ( ｈｔｔｐ: / / 果 显 示 荔 枝 ＬｃＵＦＧＴ 与 草 莓 ( Ｑ６６ＰＦ５ )、 白 梨
ｗｗｗ.ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＴＭＨＭＭ / ) 在线工具预测 ( Ａ０Ａ０Ａ０Ｐ５４７ )、 苹 果 ( Ｑ９ＸＥＳ４ )、 山 葡 萄
其跨 膜 结 构 域ꎬ 通 过 ＮＣＢＩ 中 ＢＬＡＳＴ (( ｈｔｔｐ: / / (Ｂ６ＤＵ５３)、蓝莓( Ｘ５ＨＺＭ４)、樱桃( Ｆ２ＶＲ５１)、葡
ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ) 工具进行同源性比对分析ꎬ 萄柚(Ｃ５ＭＲ７１)和克里曼丁橘( Ｖ４ＴＳＪ３) 等的一致
用 ＤＮＡＭＡＮ ｓｏｆｔｗａｒｅ( ｖｅｒｓｉｏｎ ５.２.２.０) 软件进行多 性在 ５３％ ~ ６１％ 之间ꎮ ＬｃＵＦＧＴ 具有 ＴＤＰ 结合位
序列比对ꎬ利用 ＭＥＧＡ５.０ 采用邻近相接法( ｎｅｉｇｈ￣ 点ꎬ其三维结构类型为 ＧＴ￣Ｂ 类ꎬ在 Ｃ￣端具有一个由
ｂｏｕｒ ｊｏｉｎｉｎｇ)步长值１ ０００构建系统进化树ꎮ ４４ 个氨基酸残基组成的 ＰＳＰＧ 盒ꎬＰＳＰＧ 盒是糖基
１.５ ＬｃＵＦＧＴ 基因的表达水平分析 转移酶结合糖基供体的区域ꎬ其中第 ２２ 位、第 ２３ 位
根 据 获 得 的 ＬｃＵＦＧＴ 基 因 序 列ꎬ 用 Ｐｒｉｍｅｒ 和第 ４４ 位氨基酸在选择糖基供体中发挥重要作用ꎬ
Ｐｒｅｍｉｅｒ ５.０ 软件设计定量引物( 表 １)ꎬＲｅａｌ￣Ｔｉｍｅ ＬｃＵＦＧＴ 的 ＰＳＰＧ 第 ２２ 位为色氨酸ꎬ可定位 ＵＤＰ￣葡
ＰＣＲ 反应在罗氏 ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ｓｙｓｔｅｍ 上完成ꎬ试 萄糖ꎬ第 ２３ 位丝氨酸在 ＵＤＰ￣葡萄糖醛酸转移酶中
剂 采 用 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ 保守性强ꎬ第 ４４ 位谷氨酰胺在葡萄糖糖基转移酶中
(Ｔａｋａｒａ)ꎬ反应体系 ２０ μＬꎬ反应程序如下:９５ ℃ ꎬ 保守性很强ꎬ推测 ＬｃＵＦＧＴ 以 ＵＤＰ￣葡萄糖为主要糖
６０ ｓꎻ９５ ℃ ꎬ１５ ｓꎻ５５ ℃ ꎬ２０ ｓꎻ７２ ℃ ꎬ３０ ｓꎻ４０ 个循 基供体的葡萄糖基转移酶(图 ３)ꎮ
环ꎮ 以 ＬｃＡｃｔｉｎ 作为内参基因ꎬ每个样品 ３ 次重复ꎬ 用 ＭＥＧＡ５.０ 邻近相接法对 ＬｃＵＦＧＴ 蛋白及其
－ΔΔＣＴ ( Ｌｉｖａｋ ＆ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎꎬ ２００１ ) 计 算 他物种 ＵＦＧＴ 进行系统进化树分析ꎬ从图 ４ 可以看
运 用 ２
ＬｃＵＦＧＴ 基因的表达水平ꎮ 出ꎬ荔枝 ＬｃＵＦＧＴ 同源性最高ꎬ与柑橘类葡萄柚、甜
