Page 57 - 《广西植物》2023年第6期

６ 期 杨乐等: 铁皮石斛 ＳＰＬ 膜结合(ＳＴＭ)转录因子的全基因组鉴定及表达分析 １ ０ ４ ３

１.２ 试剂 数量设定在 １０ꎬ其他参数默认ꎬ进行分析ꎮ 将铁皮
ＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｕｒｅ 多糖多酚植物总 ＲＮＡ 提取试剂 石斛 ＳＴＭ 蛋白序列 Ｆａｓｔａ 格式导入 ＭＥＧＡ￣Ｘ 中进
盒(北京擎科)、琼脂糖 ( 北京擎科)、２ × ＴＳＩＮＧＫＥ 行构 树ꎬ 序 列 比 对 采 用 ＣｌｕｓｔａｌＷꎬ 选 择 Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ(北京擎科)、ＲＮＡ 无酶水(北京擎科)、 ｍｅｔｈｏｄꎬＢｏｏｔｓｔｒａｐ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ 选择 ５００ꎬＭｏｄｅｌ 选择
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ 试剂 ｐ￣ｄｉｓｔａｎｃｅꎬＧａｐｓ/ Ｍｉｓｓｉｎｇ Ｄａｔａ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ 选择 Ｐａｒｔｉａｌ

盒(宝生物)、５０×ＴＡＥ(上海生工)ꎮ ｄｅｌｅｔｉｏｎꎬＳｉｔｅ Ｃｏｖｅｒａｇｅ Ｃｕｔｏｆｆ 设定为 ５０ꎬ进行构树ꎮ
１.３ 方法 从 ＮＣＢＩ 数 据 库 中 下 载 铁 皮 石 斛 ＳＴＭ 蛋 白 的
１.３.１ 铁皮石斛 ＳＴＭ 蛋白的理化性质及亚细胞定位 ＣＤＤꎬ利用 ＴＢｔｏｏｌｓ ( Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０) 对 ＤｏＳＴＭ
分析 从 ＮＣＢＩ 数据库中下载拟南芥 ＳＴＭ 蛋白序 保守基序、保守结构域、进化树进行绘图ꎮ 将铁皮

列ꎬ将物种限定在铁皮石斛( Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ) 石斛 ＳＴＭ 蛋白的 ＣｌｕｓｔａｌＷ 比对结果导入 ＥＳＰｒｉｐｔ
并进行 ＢＬＡＳＴ 搜索ꎬ下载搜索到的铁皮石斛的 ＳＴＭ ３.０ 在线网站( ｈｔｔｐｓ: / / ｅｓｐｒｉｐｔ. ｉｂｃｐ. ｆｒ / ＥＳＰｒｉｐｔ/ ｃｇｉ￣
蛋白序列ꎬ 去除冗余序列ꎬ 利用 ＴＭＨＭＭ ( ｈｔｔｐ:/ / ｂｉｎ / ＥＳＰｒｉｐｔ.ｃｇｉ)进行分析ꎮ
ｗｗｗ.ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＴＭＨＭＭ￣２.０ / )预测跨膜结 １.３.５ 铁皮石斛 ＳＴＭ 基因结构及顺式作用元件分
构域ꎬ最终选取 ＸＰ＿０２０６８５８４８、ＸＰ＿０２０６８１９２３、ＸＰ＿ 析 从 ＮＣＢＩ 数据库中下载铁皮石斛的基因组信
０２０６７２７９５、ＸＰ＿０２０６８８５４２ 这 ４ 个蛋白进行研究ꎬ并 息ꎬ用 ＴＢｔｏｏｌｓ 进行基因结构绘制ꎬ同时获得启动子
分别 命 名 为 ＤｏＳＴＭ１、 ＤｏＳＴＭ２、 ＤｏＳＴＭ３、 ＤｏＳＴＭ４ꎮ 上游 ２ ０００ ｂｐ 的 序 列 信 息ꎬ 获 得 的 序 列 信 息 用
利用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ(ｈｔｔｐｓ:/ / ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ/ ) ＰｌａｎｔＣＡＲＥ ( Ｌｅｓｃｏｔ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００２ ) 网 站 ( ｈｔｔｐ:/ /
分析铁皮石斛 ＳＴＭ 蛋白家族的理化性质ꎮ 用 Ｐｌａｎｔ￣ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ.ｐｓｂ.ｕｇｅｎｔ.ｂｅ/ ｗｅｂｔｏｏｌｓ/ ｐｌａｎｔｃａｒｅ/ ｈｔｍｌ/ )
ｍＰＬｏｃ(ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ.ｃｓｂｉｏ.ｓｊｔｕ.ｅｄｕ.ｃｎ / ｂｉｏｉｎｆ/ ｐｌａｎｔ/ ) 进行顺式作用元件预测ꎬ并用 ＴＢｔｏｏｌｓ 进行绘图ꎮ
(Ｃｈｏｕ ＆ Ｓｈｅｎꎬ ２００７)对 ＤｏＳＴＭ 蛋白家族进行亚细 １.３.６ 引物设计 利用 ４ 个 ＤｏＳＴＭ 的 ｃＤＮＡ 序列ꎬ
胞定位分析ꎮ 将所得的 ｃＤＮＡ 序列用 Ｐｒｉｍｅｒ￣ＢＬＡＳＴ 进行引物设
１.３.２ 铁皮石斛 ＳＴＭ 家族的系统进化树分析 从 计ꎬ引物大小设定为 １８ ~ ２２ ｂｐꎬＰＣＲ 产物大小设
ＮＣＢＩ 数据库中下载野蕉 ( Ｍｕｓａ ｂａｌｂｉｓｉａｎａ)、铁皮 定为 ４００ ~ ８００ ｂｐꎬ其他参数均为默认参数ꎬ在输出
石斛 ( Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ)、拟南芥 ( Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ 的引物中选择靠近 ３′端的作为试验所用引物ꎬ选
ｔｈａｌｉａｎａ)、蝴蝶兰 ( Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｅｑｕｅｓｔｒｉｓ)、毛白杨 用 ＥＦ１￣α 做内参ꎬ相应的引物序列如表 １ 所示ꎮ
( Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｏｍｅｎｔｏｓａ )、 扇 形 文 心 兰 ( Ｅｒｙｃｉｎａ
ｐｕｓｉｌｌａ)、玉米 (Ｚｅａ ｍａｙｓ)、水稻 ( Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ)、生 表 １ 引物序列
姜 ( Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ) 的 ＳＴＭ 蛋白序列 Ｆａｓｔａ 格 Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
式ꎮ 用 ＭＥＧＡ￣Ｘ 邻近法构建进化树ꎬ序列比对采 基因名称 引物序列
Ｇｅｎｅ ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
用 ＣｌｕｓｔａｌＷꎬ 选 择 Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｍｅｔｈｏｄꎬ Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ
Ｆ:ＧＴＣＴＡＴＣＡＧＣＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣ
ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ 选择 ５００ꎬＭｏｄｅｌ 选择 ｐ￣ｄｉｓｔａｎｃｅꎬＧａｐｓ/ ＤｏＳＴＭ１ Ｒ:ＣＧＣＧＣＡＴＡＧＴＣＴＴＣＡＧＧＡＧＴ
Ｍｉｓｓｉｎｇ Ｄａｔａ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ 选 择 Ｐａｒｔｉａｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎꎬ Ｓｉｔｅ Ｆ:ＣＴＴＴＣＴＧＡＴＧＣＡＡＴＣＧＧＧＣＧ
ＤｏＳＴＭ２
Ｃｏｖｅｒａｇｅ Ｃｕｔｏｆｆ 设定为 ５０ꎬ进行建树ꎮ 建树结果在 Ｒ:ＡＴＡＡＧＧＣＡＴＧＴＴＧＡＣＧＧＣＣＡ
ＩＴＯＬ(ｈｔｔｐｓ: / / ｉｔｏｌ.ｅｍｂｌ.ｄｅ / )中进行美化ꎮ ＤｏＳＴＭ３ Ｆ:ＴＧＡＧＣＣＧＡＧＣＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧ
Ｒ:ＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＧＧＡＡＧＡＡＣＡＡ
１.３.３ 铁皮石斛 ＳＴＭ 蛋白质二级结构预测 利用
Ｆ:ＡＧＣＡＧＴＧＡＴＴＧＴＧＧＧＣＡＴＧＡ
ＤｏＳＴＭ４
ＳＯＰＭＡ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｎｐｓａ￣ｐｒａｂｉ. ｉｂｃｐ. ｆｒ / ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｎｐｓａ ＿ Ｒ:ＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＴＣＡ
ａｕｔｏｍａｔ.ｐｌ? ｐａｇｅ ＝ ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ.ｈｔｍｌ) 在线网站对铁 ＥＦ１￣α Ｆ:ＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＡＴＡＣＴＣＣ
皮石斛 ＳＴＭ 蛋白质的二级结构进行分析ꎬ参数为 Ｒ:ＴＣＣＣＴＡＡＣＡＧＣＧＡＡＡＣＧＴＣＣ

默认值ꎮ
１.３.４ 铁皮石斛 ＳＴＭ 蛋白质序列比对及保守基序 １.３.７ 铁皮石斛 ＳＴＭ 基因表达分析 将铁皮石斛
分析 将 ４ 个 ＤｏＳＴＭ 蛋白导入 ＭＥＭＥ ( Ｂａｉｌｅｙ ＆ 幼苗分别置于 １ / ２ＭＳ 液体培养基、含 １００ ｍｍｏｌ
￣１
￣１
Ｅｌｋａｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９４ ) 在 线 网 站 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｍｅｍｅ￣ Ｌ ＮａＣｌ 的 １ / ２ＭＳ 液体培养基、含 ５ μｍｏｌＬ 脱落
ｓｕｉｔｅ.ｏｒｇ / ｍｅｍｅ / ｔｏｏｌｓ/ ｍｅｍｅ) 进行分析ꎬ将 ｍｏｔｉｆｓ 的 酸的 １ / ２ＭＳ 液体培养基、含 １０％ＰＥＧ 的 １ / ２ＭＳ 液