Page 86 - 《广西植物》2023年第6期

１ ０ ７ ２ 广 西 植 物 ４３ 卷
ＲＬＫｓ 通过磷酸化作用传递信号进而响应胁迫ꎮ 究所提供ꎬ并经实验室早期筛选鉴定出的铝敏感品
在冷胁迫下ꎬ激酶 ＯＳＴ１(ＯＰＥＮ ＳＴＯＭＡＴＡ １)活性被 种‘中花 ２ 号’ (‘ＺＨ２’) 和耐铝品种‘９９￣１５０７’ (詹
激活ꎬ通过磷酸化 ＩＣＥ１( Ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ ＣＢＦ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 洁等ꎬ２００８)ꎮ 将花生种子经湿润珍珠岩催芽 ３ ｄ
１)来增加该转录因子的蛋白稳定性和转录活性ꎬ进 后ꎬ去除花生种皮并掐除约 １ ｃｍ 的主根根尖ꎬ在 ２６

而增 强 拟 南 芥 对 低 温 的 抵 抗 能 力 ( Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ℃条件下将材料置于改良的 Ｈｏａｇｌａｎｄ 营养液中培
２０１５)ꎮ ＣＩＰＫ２６( ＣＢＬ￣ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ２６) 养至第三片真叶长出ꎬ转移花生幼苗至 １００ μｍｏｌ
￣１
与 ＲＢＯＨＦ(ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｂｕｒｓｔ ｏｘｉｄａｓｅ ｈｏｍｏｌｏｇ Ｆ) 的 Ｎ Ｌ ＣａＣｌ 溶液(ｐＨ ４.２) 中培养 ２４ ｈꎬ之后做以下两
２
端存在相互作用ꎬ 并且可磷酸化 ＲＢＯＨＦ 来刺激 种处理:一是用 １００ μｍｏｌＬ ＡｌＣｌ 溶液( 含 １００
￣１
３
ＲＯＳ 产生ꎬ进而影响 ＲＢＯＨＦ 在植物胁迫应答中的 μｍｏｌＬ ＣａＣｌ ꎬｐＨ ４.２) 分别处理花生幼苗 ４、８、
￣１
２
调控(Ｄｒｅｒｕｐ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３)ꎮ ＳＯＢＩＲ１(ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｎ ｏｆ １２、２４ ｈꎻ二是用不同浓度的 ＡｌＣｌ 溶液 ( ５０、１００、
３
ＢＩＲ１￣１)激酶依赖于其蛋白浓度发生自磷酸化ꎬ其 ￣１
２００、４００ μｍｏｌＬ )分别处理花生幼苗 ４ ｈ 和 ８ ｈꎮ
第 ５２９ 位的苏氨酸以及 β３￣αＣ 环结构对磷酸化至 以上两种处理均以改良的 Ｈｏａｇｌａｎｄ 营养液处理作
关重要ꎬ 并影响 ＳＯＢＩＲ１ 对烟草细胞死亡的调控
为对照ꎬ取约 １ ｃｍ 的根尖作为实验材料ꎮ
( Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２２ )ꎮ 拟 南 芥 ＣＰＫ２８ ( ｃａｌｃｉｕｍ￣ １.２ ＲＮＡ 提取
ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ２８)可响应拟南芥 Ｃａ 信号 先参照植物总 ＲＮＡ 提取试剂盒( Ｐｒｏｍｅｇａ) 方
２＋
路径参 与 免 疫 反 应 和 生 长 发 育 调 控ꎬ 研 究 发 现 法提取 ＲＮＡꎬ之后参照反转录试剂盒( Ｔａｋａｒａ) 方
ＣＰＫ２８ 具自磷酸化活性ꎬ并随着 Ｃａ 浓度增加而活
２＋
法进行 ＲＮＡ 反转录ꎬ获得 ｃＤＮＡꎮ
性增强ꎬ其中第 ３１８ 位丝氨酸是关键活性位点ꎬ尽管 １.３ ＡｈＰＲＫ４ 在铝胁迫下表达量检测
该位点突变不会影响 ＣＰＫ２８ 调控营养生长和生殖 根据 ＡｈＰＲＫ４ 基因 ＣＤＳ(ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ)序列
生长时期的转换ꎬ却会对 ＡｔＰｅｐ１ 引发的氧化应激表
设计 荧 光 定 量 ＰＣＲ 检 测 引 物 ( 表 １)ꎬ 参 照 ＴＢ
现高敏性状ꎬ同时对丁香假单胞菌具有更强的抵抗
Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｐ ＩＩ 酶(Ｔａｋａｒａ)说明ꎬ设置 ｑＲＴ￣
力(Ｂｒｅｄｏｗ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２１)ꎮ 这表明 ＲＬＫｓ 的磷酸化活 ＰＣＲ 反应体系和程序ꎬ以 ＵＢＱ１０Ｒ 为 内 参ꎬ采 用
性与这些蛋白在植物胁迫应答中的作用密切相关ꎮ －△△Ｃｔ
２ 法进行基因相对表达量的分析ꎮ
通过对实验室已有转录组数据的挖掘(Ｘｉａｏ ｅｔ
ａｌ.ꎬ ２０２１)ꎬ我们发现花粉类受体蛋白激酶基因
表 １ 引物序列
ＡｈＰＲＫ４ 转录受铝胁迫处理的诱导ꎬ并且在不同花 Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
生铝耐性品种中有着不同的响应模式ꎬ暗示其参
引物名称
与花生铝胁迫响应过程ꎮ 本研究以 ＡｈＰＲＫ４ 的铝 Ｐｒｉｍｅｒ 引物序列(５′￣３′) 用途
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ(５′￣３′) Ｐｕｒｐｏｓｅ
ｎａｍｅ
胁迫响应模式和蛋白活性为研究内容ꎬ采用 ｑＲＴ￣
ＡｈＰＲＫ４￣Ｆ１ ＧＡＴＧＣＡＴＴＣＧＴＣＧＧＣＡＴＧＡＧ 荧光定量
ＰＣＲ 检 测 了 不 同 铝 浓 度 和 处 理 时 间 条 件 下ꎬ
ＡｈＰＲＫ４￣Ｒ１ ＧＣＴＡＧＧＡＡＴＡＴＧＧＣＣＧＣＴＧＡ ｑＲＴ￣ＰＣＲ
ＡｈＰＲＫ４ 在花生耐铝品种‘９９￣１５０７’ 和铝敏感品种 ＵＢＱ１０Ｒ￣Ｆ ＣＧＣＡＣＡＣＴＣＧＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＣ
‘中花 ２ 号’ (‘ ＺＨ２’) 的转录变化ꎬ对 ＡｈＰＲＫ４ 胞 ＵＢＱ１０Ｒ￣Ｒ ＣＡＣＧＧＡＧＡＣＧＧＡＧＧＡＣＡＡＧＧ 原核表达( 下划线
ＡｈＰＲＫ４￣Ｆ２ ＧＡＡＴＴＣＧＴＴＴＣＡＡＧＴＧＡＴＧＡＧＧ 表示酶切位点)
内域进行克隆ꎬ并开展了原核表达分析ꎬ通过磷酸 ＣＣＡＡＧＡＴ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
化抗体对其自磷酸化活性进行检测ꎬ拟探讨以下 ＡｈＰＲＫ４￣Ｒ２ ＣＴＣＧＡＧＡＡＧＡＧＴＴＴ (ｕｎｄｅｒｌｉｎｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ
ＣＣＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧＡＣＡＡＧ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｓｉｔｅ)
问题:(１)ＡｈＰＲＫ４ 的铝响应模式ꎻ(２) ＡｈＰＲＫ４ 胞
内域的磷酸化状态ꎮ 为后续在蛋白质水平上探究
ＡｈＰＲＫ４ 蛋白的生化功能以及在铝胁迫下的作用 １.４ 生物信息学分析

机制奠定基础ꎮ 利用在线网站 ＰｒｏｔＰａｒａｍ ｔｏｏｌ 预测 ＡｈＰＲＫ４ 的分
子量、等电点等理化性质( ｈｔｔｐｓ:/ / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ/
１ 材料与方法 ｐｒｏｔｐａｒａｍ/ )ꎻ通过 ＷｏＬＦ ＰＳＯＲＴ 来预测其亚细胞定
位(ｈｔｔｐｓ:/ / ｗｏｌｆｐｓｏｒｔ.ｈｇｃ.ｊｐ/ )ꎻ通过 ＮＣＢＩ 比对获得其
１.１ 材料 他物种对应的基因序列ꎬ利用 ＭＥＧＡ ７.０ 构建进化
供试花生品种由中国农业科学院油料作物研 树ꎬ并在软件 ＤＮＡＭＡＮ 进行多序列比对ꎬ同时通过