Page 87 - 《广西植物》2023年第6期
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６ 期 苏桂军等: 花生铝响应类受体蛋白激酶 ＡｈＰＲＫ４ 的原核表达分析 １ ０ ７ ３
ＮＣＢＩ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ 预测 ＡｈＰＲＫ４ 蛋白的保守结
构域 ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ/ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ/ ｃｄｄ/ ２ 结果与分析
ｗｒｐｓｂ.ｃｇｉ)ꎮ 对于目的蛋白的跨膜域以及信号肽分析
分别通过在 线 网 站 ＴＭＨＭＭ ２. ０ ( ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ. ｃｂｓ. ２.１ ＡｈＰＲＫ４ 在不同铝处理时间、浓度下的表达
ｄｔｕ. ｄｋ/ ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＴＭＨＭＭ/ ) 和 ＳｉｇｎａｌＰ ４. １ ｓｅｒｖｅｒ 由图 １:Ａ 可知ꎬ‘ＺＨ２’ 和‘９９￣１５０７’ 经铝处理
(ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ.ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ/ ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＳｉｇｎａｌＰ￣４.１/ )完成ꎬ 不同时间后ꎬ与对照相比ꎬＡｈＰＲＫ４ 的表达量均上
同时对 ＡｈＰＲＫ４ 的磷酸化位点以及互作蛋白进行 升ꎬ但两个花生品种中 ＡｈＰＲＫ４ 的表达趋势有所差
了预测ꎬ磷酸化预测软件为 ｉＧＰＳ １.０ꎬ互作蛋白预 异ꎬ‘ＺＨ２’中ꎬＡｈＰＲＫ４ 在 ４ ｈ 的表达量最高ꎬ８ ｈ 的
测网 站 为 ＳＴＲＩＮＧ(ｈｔｔｐｓ:/ / ｓｔｒｉｎｇｄｂ.ｏｒｇ/ ｃｇｉ/ ｉｎｐｕｔ.ｐｌ? 表达量最低ꎬ随后表达量则一直增加ꎮ ‘９９￣１５０７’
ｓｅｓｓｉｏｎＩｄ ＝ Ｋ７ｇＤｃＰｓＫｏ９Ｅ０＆ｉｎｐｕｔ ＿ｐａｇｅ ＿ａｃｔｉｖｅ ＿ｆｏｒｍ ＝ 中ꎬＡｈＰＲＫ４ 表达量则先增加后降低ꎬ在 １２ ｈ 达到
ｓｉｎｇｌｅ ＿ ｓｅｑｕｅｎｃｅ )ꎮ ＡｈＰＲＫ４ 启 动 子 元 件 预 测 于 最高ꎮ 由图 １:ＢꎬＣ 可知ꎬ在经不同铝浓度处理 ４ ｈ
ＰｌａｎｔＣＡＲＥ 在 线 网 站 进 行 ( ｈｔｔｐ:/ / ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. 和 ８ ｈ 后ꎬ发现在两个花生品种中 ＡｈＰＲＫ４ 的表达
ｐｓｂ.ｕｇｅｎｔ.ｂｅ/ ｗｅｂｔｏｏｌｓ/ ｐｌａｎｔｃａｒｅ/ ｈｔｍｌ/ )ꎮ 量随着处理浓度的增加同样呈先增加后降低的趋
１.５ ＡｈＰＲＫ４ 激酶域克隆和原核表达载体构建 势ꎻ且在不同铝浓度处理 ８ ｈ 时ꎬＡｈＰＲＫ４ 在耐铝性
从 ＮＣＢＩ 上搜索得到 ＡｈＰＲＫ４ 的基因序列ꎬ运 品种‘９９￣１５０７’ 中的响应比敏感性品种‘ ＺＨ２’ 更
用软件 ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ ５ 设计激酶域克隆引物( 表 剧烈ꎮ 综上所述ꎬ这些结果表明 ＡｈＰＲＫ４ 是铝胁迫
１)ꎮ 以 ‘ ＺＨ２ ’ 根 尖 ｃＤＮＡ 为 模 板ꎬ 克 隆 获 得 响应基因ꎮ
ＡｈＰＲＫ４ 的 胞 内 激 酶 域ꎬ 参 照 ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓｌｌ Ｏｎｅ ２.２ ＡｈＰＲＫ４ 的生物信息学分析
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ 试剂盒方法连接 ＡｈＰＲＫ４￣ＣＤ 至 ｐＧＥＸ￣ ２.２.１ ＡｈＰＲＫ４ 蛋白理化性质、结构特征及亲缘关
６ｐ￣１ 载体(双酶切位点为 ＥｃｏＲ Ｉ 和 Ｘｈｏｌ)ꎬ热激转 系的分析 分析 ＡｈＰＲＫ４( ＬＯＣ１１２７１８３３３) 的序列
化至 ＤＨ５αꎬ将经过测序验证正确的阳性克隆菌株 信息可 知ꎬ该 基 因 ＣＤＳ ( ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ) 全 长 为
提取质粒(ＡｈＰＲＫ４￣ＣＤ￣ｐＧＥＸ￣６ｐ￣１)ꎮ ２ ０２２ ｂｐꎬ编码 ６７３ 个氨基酸ꎮ 经预测该蛋白质分
１.６ ＡｈＰＲＫ４ 蛋白的原核表达和纯化 子量为 ７４.９２ ｋＤꎬ理论等电点为 ６.０６ꎻ ＡｈＰＲＫ４ 蛋
将 ＡｈＰＲＫ４￣ＣＤ￣ｐＧＥＸ￣６ｐ￣１ 重 组 质 粒 转 化 至 白 Ｎ 端具多个亮氨酸重复结构域ꎬＣ 端具丝氨酸 /
Ｒｏｓｅｔｔａ 感受态细胞ꎬ３７ ℃ 培养至 ＯＤ ＝ ０.６ ~ ０.８ꎬ 苏氨酸特异性蛋白激酶结构域ꎬ激酶域含有 ＡＴＰ
６００
加入终浓度为 ０.５ ｍｍｏｌＬ 的异丙基￣β￣Ｄ￣硫代半 结合位点ꎬ并与其他物种 ＰＲＫ 成员的激酶域具较
￣１
乳糖苷( ＩＰＴＧ)ꎬ在 １６ ℃ 下诱导 ＧＳＴ￣ＡｈＰＲＫ４￣ＣＤ 高的同源性( 图 ２)ꎻＡｈＰＲＫ４ 蛋白含有两个跨膜
蛋白表达ꎬ经 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 电泳检测蛋白的表达情 域ꎬ属于膜功能蛋白ꎮ 因此ꎬＡｈＰＲＫ４ 蛋白属于具
况ꎮ 参考 Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ 填料(ＧＥ 公司) 有跨膜域和信号肽的丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶ꎮ
说明纯化 ＡｈＰＲＫ４￣ＣＤ 重组蛋白ꎬ并进行 Ｗｅｓｔｅｒｎ 进化树构建结果显示 ＡｈＰＲＫ４ 独立成一个分
Ｂｌｏｔ 验证ꎮ 支ꎬ与比对的 ９ 个物种之间有较大的差异ꎻ 拟南芥
１.７ ＧＳＴ￣ＡｈＰＲＫ４￣ＣＤ 自磷酸化检测 中ꎬＡｈＰＲＫ４ 与 ＡｔＰＲＫ１ 和 ＡｔＰＲＫ４ 有较高的同源
加 ０.５ μｇ 的 ＧＳＴ￣ＡｈＰＲＫ４￣ＣＤ 蛋白到 １００ μＬ 性(图 ３)ꎮ 进一步查询花生 ＬＲＲ￣ＲＬＫ 家族分类ꎬ
￣１
ＰＢＳ 磷酸缓冲液(含 ２５ ｍｍｏｌＬ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌꎬｐＨ ７.５ꎬ ＡｈＰＲＫ４ 属于 ＬＲＲ￣ＩＩＩ 蛋白激酶家族( Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ
￣１ ￣１ ２０２１)ꎮ 经预测 ＡｈＰＲＫ４ 具可磷酸化的氨基酸位
１０ ｍｍｏｌＬ ＭｇＣｌ ꎬ１０ ｍｍｏｌＬ ＭｎＣｌ ꎬ１ ｍｍｏｌ
２ ２
Ｌ ＤＴＴꎬ１×蛋白酶抑制剂和 １ ｍｇｍＬ ＡＴＰ)中ꎬ以 点ꎬ包括丝氨酸( Ｓ) 和苏氨酸( Ｔ)ꎮ 因此ꎬＡｈＰＲＫ４
￣１
￣１
不加 ＡＴＰ 为对照组ꎬ混合液于 ２８ ℃下孵育 １０ ｍｉｎꎬ 可能与 ＡｔＰＲＫ１ 和 ＡｔＰＲＫ４ 具相近的功能ꎬ可能发
并于 １００ ℃下孵育 １０ ｍｉｎ 变性ꎬ后取 ３０ μＬ 样品经 生磷酸化ꎮ
１２％ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 分离ꎬ并转膜依次用兔抗的酪氨酸 ２.２.２ ＡｈＰＲＫ４ 启动子分析和互作蛋白预测 经花
磷酸化抗体(Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ 公司)、苏氨酸磷酸化抗 生基因组序列提取ꎬ得到 ＡｈＰＲＫ４ 基因 ＡＴＧ 前长
体(Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ 公司)以及鼠抗的 ＧＳＴ 抗体(康为 ２ ０００ ｂｐ 的启动子序列ꎮ 分析启动子元件ꎬ结果表
世纪公司) 孵育并化学显色ꎬ根据对照组和处理组 明:ＡｈＰＲＫ４ 的启动子元件包括生长素响应元件、
条带差异判断磷酸化及激酶活性ꎮ ＡＢＡ 响应元件、 ＭｅＪＡ 响应元件等激素响应元件ꎬ
