Page 127 - 《广西植物》2023年第8期

８ 期 王晶等: 阿尔泰银莲花根际土壤微生物多样性研究 １ ４ ６ ９

白(陈国典等ꎬ２０２０)ꎮ 因此ꎬ本研究对阿尔泰银莲 将每个样方 ５ 个采样点的土壤均匀混合为一个样
花根际土壤微生物群落结构进行探究ꎬ具有较大 品ꎮ 野生和栽培阿尔泰银莲花根际土壤样品各 ３
的研究价值ꎮ 份ꎮ 从采集的土壤中去除残留的根系和碎石ꎮ 随
本研究以白云山国家级自然保护区为研究区 后将土壤样品分为两份ꎬ一份装入无菌 ５ ｍＬ 的离
域ꎬ以野生和栽培阿尔泰银莲花为研究对象ꎬ采用 心管ꎬ将其带回实验室保存在－８０ ℃ 冰箱中ꎬ用于
高通量测序技术对阿尔泰银莲花根际土壤微生物 后期提取土壤微生物总 ＤＮＡꎻ另一份土壤过 ２ ｍｍ
群落进行深入研究ꎮ 拟探讨以下问题:(１) 野生和 筛去除杂质后并风干ꎬ用于测定土壤的理化性质ꎮ

栽培阿尔泰银莲花根际土壤微生物多样性分析ꎻ １.２ 土壤理化性质测定
(２)野生和栽培阿尔泰银莲花根际土壤微生物群 参照«土壤农化分析»土壤理化性质的常规方
落组成及差异分析ꎻ(３)识别影响阿尔泰银莲花根 法测 定 有 机 质、 ｐＨ、 有 效 磷、 碱 解 氮 ( 鲍 士 旦ꎬ
际土壤微生物的主要驱动因素ꎮ 本研究以期为阿 ２０１０)ꎮ 土壤 ｐＨ 采用玻璃复合电极 ｐＨ 计测定ꎻ
尔泰银莲花科学种植以及土壤改良提供理论依据 有机质采用重铬酸钾容量法测定ꎻ碱解氮采用培

和指导ꎮ 养皿扩散法测定ꎻ有效磷采用 ＮａＨＣＯ 浸提—钼蓝
３
比色法测定(张彧娜等ꎬ２０２２)ꎮ
１ 材料与方法 １.３ 土壤微生物总 ＤＮＡ 提取、ＰＣＲ 扩增及高通量
测序
１.１ 研究地点和样品采集 根据 ＦａｓｔＤＮＡ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｏｉｌ 试 剂 盒 ( ＭＰ
®
白云山国家级自然保护区(１１１°４８′—１１２°１６′ Ｅ、 Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓꎬ Ｎｏｒｃｒｏｓｓꎬ ＧＡꎬ Ｕ. Ｓ.) 的操作说明ꎬ 从
３３°３３′—３３°５６′ Ｎ)位于河南省洛阳市嵩县南部的 ０.５ ｇ 冷冻土壤样品中提取总 ＤＮＡꎮ 引物对应区域:
２
伏牛山腹地ꎬ总面积达 １６ ８００ ｋｍ ꎬ平均海拔１ ８００ 细菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基 因 的 扩 增 引 物 为 ５１５Ｆ ( ５′￣
ｍꎮ 研究区属于典型的大陆性季风气候ꎬ夏季高温 ＧＴＧＣＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡ￣３′)和 ８０６Ｒ(５′￣ＧＧＡＣＴ
多雨ꎬ冬季寒冷干燥ꎬ气温 １３.１ ~ １３.９ ℃ ꎬ年均降 ＡＣＨＶＧＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ￣３′)ꎻ真菌 ＩＴＳ 区域的扩增
雨量１ ２００ ｍｍꎮ 白云山国家级森林公园属于暖温 引物为 ＩＴＳ１Ｆ(５′￣ＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＡＡ￣３′)
带向北亚热带过渡的地段ꎬ南北植物交汇ꎬ植被茂 和 ＩＴＳ２Ｒ(５′￣ＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣ￣３′)(Ｊｉｎ ｅｔ
盛ꎬ地理景观高度多样化ꎬ为阿尔泰银莲花的生长 ａｌ.ꎬ ２０２２)ꎮ ＰＣＲ 扩增程 序 如 下: ９５ ℃ 预 变 性 ５
与繁殖创造了良好环境条件ꎮ ｍｉｎꎬ９５ ℃变性 ３０ ｓꎬ５５ ℃退火 ３０ ｓꎬ７２ ℃延伸 ３０ ｓꎬ
取样点位于白云山国家级自然保护区ꎬ栽培 共循环 ２７ 次ꎻ最后在 ７２ ℃ 下延伸 １０ ｍｉｎ(严少娟
阿尔泰银莲花是将根茎剪成 ３ ~ ５ ｃｍ 小段ꎬ按行株 等ꎬ２０２２ꎻ 汪汉成等ꎬ２０２２)ꎮ 将分离纯化后的 ＰＣＲ
间距开 沟、平 栽、覆 土ꎬ植 株 栽 植 密 度 设 置 为 ３０ 产物进行 ＤＮＡ 文库的构建ꎬ并利用上海美吉生物医
ｃｍꎬ种植密度较稀疏ꎮ 栽培阿尔泰银莲花取样地 药科技有限公司的 Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ 平台进行高通量
为林下人工管理种质资源圃ꎬ环境无阳光暴晒ꎬ阴 测序ꎮ
暗潮湿ꎬ一般不需要浇水ꎮ 人工栽培生境与野生 １.４ 数据处理与分析
环境相仿ꎬ阿尔泰银莲花均生长于优势种锐齿槲 基于 Ｑｉｉｍｅ２( ｈｔｔｐｓ: / / ｑｉｉｍｅ２. ｏｒｇ) 分析平台对
栎林下ꎬ土壤养分状况基本一致ꎮ 栽培阿尔泰银 原始数据进行区分并归类ꎬ去除嵌合体ꎬ根据序列
莲花与野生阿尔泰银莲花的距离大约为 ２ ｋｍꎬ其 相似度(９７％)构建操作分类单元(ＯＴＵｓ) ( Ｙａｎｇ ｅｔ
２ ａｌ.ꎬ ２０１８)ꎮ 为了分析野生和栽培阿尔泰银莲花
生长年限为 ２ ~ ３ 年ꎬ栽培面积大约为 １ ｈｍ ꎮ
２０２１ 年 ５ 月ꎬ分别采集野生和栽培阿尔泰银 根际微生物群落的差异性ꎬ绘制稀释曲线探究取
莲花根际土壤ꎬ根际土壤定义为轻轻摇动附着在 样数据的合理性ꎬ并通过韦恩图、ＮＭＤＳ 分析方法

植物根部(包括侧根)的土壤ꎮ 随机设置了 ３ 个 ２０ 和 Ａｌｐｈａ 多样性指数分析土壤微生物群落结构的
ｍ × ２０ ｍ 的重复样方ꎬ每两个样方之间的间隔超 差异ꎮ
过 ３０ ｍꎮ 在每个样方内利用五点采样法ꎬ随机选 为了探究野生和栽培阿尔泰银莲花根际土壤
取每个点附近 ５ 株以上的阿尔泰银莲花ꎬ使用无 微生物群落组成ꎬ采用 Ｃｉｒｃｏｓ 图和物种丰度堆积柱
菌刷子将与根系紧密附着的根际土壤刷掉ꎬ最后 状图对微生物群落组成进行可视化分析ꎬ并利用