Page 56 - 《广西植物》2024年第12期
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２ ２ １ ４ 广 西 植 物 ４４ 卷
含量紧密相关ꎬ该基因主要在木薯块根中发挥作 ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ￣Ｆ ( １０ μｍｏｌ Ｌ ) ２. ５ μＬ、
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用(Ｒａｂｂｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２２)ꎮ 前人对木薯糖转运蛋白 ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ￣Ｒ (１０ μｍｏｌＬ ) ２.５ μＬ、ｃＤＮＡ 模
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ＳＷＥＥＴ 家族基因的研究多集中在基因克隆ꎬ糖转 板 ０.５ μＬ、灭菌水补足 ５０ μＬꎮ 扩增程序:９５ ℃ 预
运特性分析及非生物胁迫的表达特性等ꎬ其调控 变性 ５ ｍｉｎꎻ ９５ ℃ ３０ ｓ、５６ ℃ ３０ ｓ、７２ ℃ １ ｍｉｎꎬ共
木薯块根淀粉含量、干物率的作用机制还未深入 ３４ 个循环ꎻ７２ ℃ 延伸 １０ ｍｉｎꎮ ０.８％的琼脂糖凝胶
研究ꎮ 本 研 究 前 期 研 究 发 现ꎬ 木 薯 糖 转 运 蛋 白 电泳分离 ＰＣＲ 扩增产物ꎬ回收纯化目的条带ꎬ克隆
ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ 与 ＭｅＳＷＥＥＴ１８ 亲缘关系最近ꎬ但其 至 ｐＥＡＳＹ￣Ｂｌｕｎｔ Ｓｉｍｐｌｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ 载体上测序ꎮ
功能尚未报道ꎮ 因此ꎬ本研究以木薯‘ ＫＵ５０’ 为研 １.２.３ 生物信息学分析 利用 ＮＣＢＩ 网站 ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ
究材料ꎬ通过克隆、亚细胞定位、糖转运特性分析 软件对获得的 ＫＵ５０ ｃＤＮＡ 序列进行开放阅读框
以及非生物胁迫等方法ꎬ探究木薯 ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ (ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅꎬＯＲＦ)预测ꎬ同时翻译成蛋白序
的蛋白质性质、糖转运特性以及非生物胁迫下的 列ꎻＰｒｏｔＰａｒａｍ 软件分析该蛋白的分子量与等电点ꎻ
表达变化ꎮ 拟探讨与 ＭｅＳＷＥＥＴ１８ 亲缘关系最近 ＮＣＢＩ 在 线 软 件 ＣＤＤ 分 析 蛋 白 的 保 守 结 构 域ꎻ
的 ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ 在木薯中的表达情况ꎬ从而为糖 ＴＭＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ ｖ.２.０ 在线软件进行跨膜结构域分
转 运 蛋 白 ＳＷＥＥＴｓ 在 木 薯 中 的 功 能 研 究 提 供 析ꎻＰｒｏｔＳｃａｌｅ 在线软件预测该氨基酸序列的疏水性/
依据ꎮ 亲 水 性ꎻ ＳＯＰＭＡ ＳＥＣＯＮＤＡＲＹ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ
ＰＲＥＤＩＣＴＩＯＮ ＭＥＴＨＯＤ 在线软件预测蛋白的二级
１ 材料与方法 结构ꎮ 从拟南芥 ＴＡＩＲ 数据库下载所有 ＳＷＥＥＴ 的
蛋白序 列ꎬ 利 用 ＭＥＧＡ ５. ０ 软 件ꎬ 选 择 邻 接 模 型
１.１ 材料 (ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇꎬＮＪ)ꎬ并进行 １ ０００ 次 Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 统
本研究采用生长于中国热带农业科学院热带 计学检验ꎬ构建包括 ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ 蛋白序列在内的
作物 品 种 资 源 研 究 所 国 家 木 薯 种 质 资 源 圃 的 木薯和拟南芥 ＳＷＥＥＴ 蛋白的系统进化树ꎮ 利用
‘ＫＵ５０’种质作为研究材料ꎬ分别取‘ＫＵ５０’ 形成期 ＤＮＡＭＡＮ 软件比对 ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ 与 ＡｔＳＷＥＥＴ１６、
(植后 ４ 个月)、膨大期(植后 ７ 个月) 及成熟期(植 ＡｔＳＷＥＥＴ１７ 的序列同源性ꎮ
后 １０ 个月) 叶片、叶柄、茎杆和块根ꎮ 非生物胁迫 １. ２. ４ ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ 亚 细 胞 定 位 使 用 含 有
主要是将生长 ２０ ｄ 的‘ＫＵ５０’ 水培苗ꎬ分别放入含 ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ 表达载体同源序列的引物(表 １) 扩
￣１ ￣１ 增 ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ 不含终止密码子的 ＣＤＳ 序列ꎬ利用
有 ８ ｇＬ ＮａＣｌ、１００ ｍｍｏｌＬ 甘露醇及 １０％ Ｈ Ｏ
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的溶液中进行盐、干旱和氧化处理ꎬ各处理时间分 重 组 克 隆 试 剂 盒 ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ Ⅱ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ
别为 ０ ｈ (对照ꎬＣＫ)、１２ ｈ、２４ ｈ 和 ３６ ｈꎮ 低温处理 (Ｖａｚｙｍｅ) 将 ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ 亚克隆至 ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２￣
则将水培苗直接放入植物光照培养箱采用 １５ ℃ ２４ ＧＦＰ 空 载 体 上ꎬ 构 建 亚 细 胞 定 位 载 体 ３５Ｓ ∷
ｈꎬ后降至 ４ ℃ ２４ ｈ 进行处理ꎮ 采集的样本立即在 ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ￣ＧＦＰꎬ以 ３５Ｓ∷ＧＦＰ 作为对照ꎮ 将重
液氮中冷冻并储存 － ８０ ℃ 冰箱ꎬ 每个样 本 重 复 组质粒转化农杆菌感受态细胞 ＧＶ３１０１ꎬ挑取单菌
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３ 次ꎮ 落用 ＹＥＰ 液体培养基 ( 含 ５０ μｇ ｍＬ Ｋａｎａꎬ２５
１.２ 方法 μｇｍＬ Ｒｉｆ)ꎬ２８ ℃ ２２０ ｒｍｉｎ 进行活化后扩大
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１.２.１ 总 ＲＮＡ 提取与 ｃＤＮＡ 合成 总 ＲＮＡ 的提取 培养直至菌液 ＯＤ ６００ 在 ０.８ ~ １.０ 间ꎮ 将菌液置于离
参照 ＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｕｒｅ 多糖多酚植物总 ＲＮＡ 提取试 心机中ꎬ５ ０００ ｒｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ 后收集菌体沉
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剂盒(Ｔｉａｎｇｅｎ) 的操作说明进行ꎮ ｃＤＮＡ 第一链的 淀ꎮ 用 １５ ｍＬ 侵 染 液 ( １０ ｍｍｏｌ Ｌ ￣１ ＭｇＣｌ 、 １０
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合成参照 ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ ＲＴ 逆转录试剂盒( Ｔｈｅｒｍｏ) 的 ｍｍｏｌＬ ＭＥＳ ｐＨ ５.８、１００ μｍｏｌＬ ＡＳ) 洗涤菌
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操作说明进行ꎮ 体ꎬ重复洗涤一次ꎮ 用侵染液重悬菌体ꎬ调 ＯＤ 约
６００
１.２. ２ ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ 基 因 全 长 ｃＤＮＡ 扩 增 以 为 ０.８ꎬ黑暗静置活化 ２ ~ ３ ｈꎬ侵染烟草叶片ꎬ２５ ℃
Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ １２.０ 中 Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ ｖ７.１ 数据库的 黑暗培养 ４８~７２ ｈꎬ通过荧光共聚焦激光扫描显微
ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ 序列设计引物( 表 １)ꎬ以‘ ＫＵ５０’ 的 镜观察ꎬ拍照ꎮ
ｃＤＮＡ 为模板进行序列克隆ꎮ 全长 ｃＤＮＡ 的扩增 １.２.５ 实时荧光定量 ＰＣＲ 分析 采用 Ｔｈｅｒｍｏ 公司
体 系 含 ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ ( ２ × ) ２５ μＬ、 的 ＣＦＸ 实时荧光定量 ＰＣＲ 系统ꎬ实验操作按仪器
