Page 57 - 《广西植物》2024年第12期
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１２ 期 薛晶晶等: 木薯糖转运蛋白基因 ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ 的克隆及表达分析 ２ ２ １ ５
使用说明书进行ꎮ 将 ｃＤＮＡ 稀释 １０ 倍作 为 ＲＴ￣ 表 １ 引物序列
ｑＰＣＲ 分析的模板ꎮ １０ μＬ 反应体系包含 １ μＬ 模 Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
板、５ μＬ ２ × ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ、 ０. ８ μＬ １０ 名称 序列
μｍｏｌ Ｌ ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ￣ｑＰＣＲ 引 物、灭 菌 水 补 足 Ｎａｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
￣１
ＭｅＡｃｔｉｎ￣Ｆ ５′￣ＴＧＡＴＧＡＧＴＣＴＧＧＴＣＣＡＴＣＣＡ￣３′
１０ μＬꎮ ＰＣＲ 反应程序:９５ ℃ 预变性 ３０ ｓꎬ９５ ℃ １０
ｓ、６０ ℃ ２０ ｓ 共 ４０ 个循环ꎬ循环完成后进行产物熔 ＭｅＡｃｔｉｎ￣Ｒ ５′￣ＣＣＴＣＣＴＡＣＧＡＣＣＣＡＡＴＣＴＣＡ￣３′
－△△Ｃｔ ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ￣Ｆ ５′￣ＴＴＧＧＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＡＴ￣３′
解曲线分析ꎮ 以 ＭｅＡｃｔｉｎ 作为内参基因ꎬ以 ２
算法进行基因的相对定量表达分析ꎮ ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ￣Ｒ ５′￣ＧＴＴＣＴＣＴＴＣＡＡＴＡＡＣＧＴＣＴＴＣＣ￣３′
１. ２. ６ ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ 的 糖 转 运 特 性 分 析 ＥＢＹ. ５′￣ＧＡＧＡＡＣＡＣＧＧＧＧＧＡＣＴＡＴＧＧＡＡＡ
ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ￣ｇｆｐ￣Ｆ
ＶＷ４０００ 酵母是一种己糖转运功能缺陷型酵母突 ＴＣＴＴＧＡＧＴＴＴＧ￣３′
变体ꎬ此 菌 株 无 法 在 己 糖 为 唯 一 碳 源 的 尿 嘧 啶 ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ￣ｇｆｐ￣Ｒ ５′￣ＡＡＡＧＴＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴ
ＡＡＴＴＴＣＡＴＧ￣３′
(ｕｒａ)缺陷型选择培养基 ＳＤ￣ｕｒａ 平板上生长ꎬ可以
ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ￣ｑＰＣＲ￣Ｆ ５′￣ＡＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴＴＧＴＡＴＡＴＧＣＡＣＣＡＣ￣３′
在麦芽糖为唯一碳源的选择培养基 ＳＤ￣ｕｒａ 平板上
ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ￣ｑＰＣＲ￣Ｒ ５′￣ＣＴＡＧＡＧＧＣＧＡＡＣＣＡＴＡＣＡＴＡＡＣＡＡＴ￣３′
恢复生长ꎮ 将 ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ 的 ＣＤＳ 序列构建到酵
５′￣ＡＴＡＴＡＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＧＡＴＧＧＡＡＡＴＣ
母 功 能 穿 梭 载 体 ｐＤＲ１９６ ( 表 １ ) 上ꎬ 使 用 ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ￣ｐｄｒ１９６￣Ｆ ＴＴＧＡＧＴＴＴＧ￣３′
ＴＭ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ２ ｋｉｔ 酵母
Ｙｅａｓｔｍａｋｅｒ ５′￣ＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣ ＴＴＡＡＴＴＡＴＴ
ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ￣ｐｄｒ１９６￣Ｒ
转化试剂盒(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ) 的聚乙二醇 / 醋酸锂高效酵 ＡＡＴＴＴＣＡＴＧ
母转化法将重组后的 ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ￣ｐＤＲ１９６ 质粒
转化到 ＥＢＹ. ＶＷ４０００ 酵母菌中ꎮ 在选择培 养 基 １: Ａ) ꎬ蛋白分子质量为 ２６.３２ ｋＤａꎬ理论等电点为
ＳＤ￣ｕｒａ ＋ ２％ 麦芽糖平板上划线培养ꎬ倒置于 ３０ ７.７２ꎬ不稳定系数为 ４０.５４ꎬ属于不稳定类蛋白ꎮ 通
℃ 培养箱中培养 ３ ~ ５ ｄꎮ 挑单菌落放入 ＳＤ￣ｕｒａ ＋ 过 ＮＣＢＩ 在线软件 ＣＤＤ 分析发现ꎬ该蛋白 Ｎ 端含
２％麦芽糖液体培养基中过夜摇菌 (３０ ℃ ꎬ２２０ ｒ 有 ＭｔＮ３ ＿ ｓｌｖ 蛋 白 结 构 域ꎬ 含 有 ２ 个 ＰＱ￣ｌｏｏｐ
￣１
ｍｉｎ )ꎮ 待 ＯＤ 为 １ 左右时ꎬ停止摇菌ꎮ 取 １ ｍＬ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙꎮ ＴＭＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ ｖ.２.０ 在线软件预测显
６００
菌液加入 １.５ ｍＬ 无菌离心管中ꎬ室温下ꎬ高速离 示ꎬ该蛋白含有 ７ 个跨膜结构域ꎬ是典型的膜蛋白
心 １５ ｓꎬ收集菌体ꎬ弃上清ꎮ 加入 １ ｍＬ 无菌超纯 (图 １: Ｂ)ꎻＰｒｏｔＳｃａｌｅ 预测表明ꎬＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ 蛋白
水ꎬ重悬菌体ꎬ再次高速离心 １５ ｓꎬ收集菌体ꎬ弃上 属于疏水性蛋白 ( 图 １: Ｃ)ꎻＳＯＰＭＡ 分 析 显 示ꎬ
清ꎮ 如此清洗重悬 ２ ~ ３ 次菌体ꎬ尽量降低液体培 ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ 蛋 白 二 级 结 构 由 ４９. ７９％ α￣螺 旋、
养基的影响ꎮ 取 ４ μＬ 菌液为×１ 倍ꎬ依次稀释×１０ ２７.３９％ 延伸链、４.５６％β￣转角和 １８.２６％无规则卷
倍、×１００ 倍、×１ ０００ 倍和×１０ ０００ 倍ꎬ均匀点涂到 曲组成ꎮ
施加不同唯一碳源的 ＳＤ￣ｕｒａ 选择培养基上 ( ＳＤ￣ ２.２ ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ 的系统进化树分析及氨基酸序
ｕｒａ ＋ ２％ 麦 芽 糖、 ＳＤ￣ｕｒａ ＋ ２％ 葡 萄 糖、 ＳＤ￣ｕｒａ ＋ 列比对
２％果糖、ＳＤ￣ｕｒａ ＋ ２％蔗糖)ꎬ倒置 ３０ ℃ 培养箱培 对木薯糖转运蛋白 ＳＷＥＥＴｓ 和拟南芥 ＳＷＥＥＴ
养 ３ ~ ５ ｄꎬ观察生长情况ꎮ 蛋白进行系统进化树分析ꎬ发现 ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ 与
１.２.７ 分析方法及数据处理 采用 Ｅｘｃｅｌ ２０２１ 分析 拟南芥 ＡｔＳＷＥＥＴ１６ 和 ＡｔＳＷＥＥＴ１７ 位于同一进化
数据ꎬＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５.０ 软件作图以及 Ｄｕｎｎｅｔｔｓ 枝上ꎬ属于第四亚类( Ｃｌａｄｅ Ⅳ) ( 图 ２: Ａ)ꎮ 采用
检验ꎮ ＤＮＡＭＡＮ 软 件 对 ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ、 ＡｔＳＷＥＥＴ１６ 和
ＡｔＳＷＥＥＴ１７ 氨 基 酸 序 列 进 行 比 对ꎬ 结 果 显 示
２ 结果与分析 ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ 和 ＡｔＳＷＥＥＴ１６ 的 同 源 性 达 到
５１.２４％ꎬＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ 和 ＡｔＳＷＥＥＴ１７ 的同源性达
２.１ ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ 基因全长 ＣＤＳ 克隆及蛋白质结 到 ５３.７２％ꎬ含有两个明显的 ＰＱ￣ｌｏｏｐ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ 结
构特性分析 构(图 ２: Ｂ)ꎮ
通过 ＲＴ￣ＰＣＲ 扩增及测序ꎬ获得 ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ ２.３ ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ 的亚细胞定位
基因编码框序列 ７２６ ｂｐꎬ 编码 ２４２ 个氨基酸 ( 图 将 ３５Ｓ∷ＧＦＰ 和 ３５Ｓ∷ＭｅＳＷＥＥＴ１７ｂ￣ＧＦＰ 重
