Page 86 - 《广西植物》2024年第12期

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ａｌ.ꎬ ２０１６)ꎬ而 ＮＡＣ 转录因子被认为是 ＡＢＡ 信号 １.２ ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９ 基因的克隆
途径中 的 重 要 转 录 激 活 调 控 因 子 ( Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ 基于油茶全基因组数据( ｈｔｔｐｓ: / / ｇｉｔｈｕｂ. ｃｏｍ /
２０１６)ꎮ 例 如ꎬ Ｃｈｅｎ 等 ( ２０１４) 发 现 过 表 达 水 稻 Ｈｅｎｇｆｕ￣Ｙｉｎ / ＣＯＮ ＿ ｇｅｎｏｍｅ ＿ ｄａｔａ )ꎬ 获 得 ＣｏＮＡＣ５、
ＯｓＮＡＣ 可通过 ＡＢＡ 介导的气孔关闭以降低叶片 ＣｏＮＡＣ７９ 基因序列ꎬ利用 ＳｎａｐＧｅｎｅ 软件进行基因
失水率ꎬ显著提高水稻抗旱性ꎻＳｈａｎｇ 等(２０２０) 发 特异性引物设计( 表 １)ꎮ 总 ＲＮＡ 采用 ＴａｓｔＰｕｒｅ ®
现 ＧｈｉｒＮＡＣ２ 通过调控 ＧｈＮＣＥＤ３ａ / ３ｃ 的表达ꎬ控制 Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｌａｎｔ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖａｚｙｍｅ Ｃａｔ
ＡＢＡ 的生物合成和气孔关闭ꎬ从而在棉花抗旱性 (ＲＣ４１１￣０１ꎬ诺唯赞) 试剂盒提取ꎬ方法按照说明
中发挥积极作用ꎮ 书ꎮ １％琼脂糖凝胶电泳检测 ＲＮＡ 质量ꎬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ
®
课题组前期基于二倍体油茶基因组数据ꎬ利 μＣｕｖｅｔｔｅ Ｇ１.０ 核酸蛋白测定仪检测 ＲＮＡ 浓度ꎮ
用生物信息学手段分析鉴定了油茶 ＮＡＣ 基因家族 使用 ＨｉＳｃｒｉＰＴ ｌｌｌ Ａｌｌ￣ｉｎ￣ｏｎｅ ＲＴ￣ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｐｅｒｆｅｃｔ ｆｏｒ
成员并对部分成员开展干旱胁迫下表达模式分析 ｑＰＣＲ(Ｒ３３３ꎬ诺唯赞)试剂盒反转录合成 ｃＤＮＡꎬ按
(曹瑞兰等ꎬ２０２１)ꎮ 进一步对转录组数据分析发 说明书描述的方法操作ꎮ 以获得的 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ
现 ＡＴＮＡＣ３ 亚组的 ＣｏＮＡＣ５、ＣｏＮＡＣ７９ 在干旱胁迫 ＫＬ￣ＣｏＮＡＣ５￣Ｆ / Ｒ 与 ＫＬ￣ＣｏＮＡＣ７９￣Ｆ / Ｒ 为 引 物 ( 表
ＴＭ
下表达量均上调ꎬ而系统发育分析发现同组的拟 １)ꎬ 利 用 Ｅｘ Ｐｒｅｍｉｅｒ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｄｙｅ ｐｌｕｓ
南芥 ＡｔＮＡＣ０１９、ＡｔＮＡＣ０５５、ＡｔＮＡＣ０７２ 基因ꎬ被证实 (ＴａＫａＲａꎬ大连) 高保真酶ꎬ进行 ＰＣＲ 扩增ꎮ 反应
程序:９５ ℃ １０ ｍｉｎꎬ９５ ℃ ３０ ｓꎬ５９ ~ ６２ ℃ ３０ ｓꎬ７２
参与逆境胁迫过程(Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００４ꎻ Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ
℃ ２ ｍｉｎꎬ３０ 个 循 环ꎻ７２ ℃ ５ ｍｉｎꎬ４ ℃ 保 温ꎮ 将
２００９)ꎬ因此推测 ＣｏＮＡＣ５、ＣｏＮＡＣ７９ 可能参与油茶
ＰＣＲ 扩增产物经 １％琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ目的条
干旱胁迫调控过程ꎬ但是其转录活性和调控机制
带回收纯化后将其连接至 ｐＭＤ１９￣Ｔ 克隆载体ꎬ并
尚不清楚ꎮ 本研究采用 ＴＡ 克隆获得 ＣｏＮＡＣ５ 和
转大肠杆菌 ＤＨ５α 中ꎬＰＣＲ 检测出阳性克隆ꎬ委托
ＣｏＮＡＣ７９ 的 ＣＤＳ 序列ꎬ通过生物信息学、亚细胞定
生工生物工程(上海)股份有限公司测序并比对测
位、酵母自激活和荧光定量 ＰＣＲ 分析ꎬ拟探讨以下
序结果ꎬ保菌并使用 ＥａｓｙＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＭｉｎｉＰｒｅｐ Ｋｉｔ
问题:(１)两个油茶 ＮＡＣ 基因的结构、进化关系及
(ＥＭ１０１￣０１ꎬ全式金)质粒小提试剂盒提取质粒ꎮ
其亚细胞定位ꎻ(２)自激活活性及其具体的激活区 １.３ ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９ 基因的生物信息学分析
域ꎻ(３) 两个油茶 ＮＡＣ 基因在不同组织和干旱胁
利用 Ｅｘｐａｓｙ￣ＰｒｏｔＰａｒａｍ 对测序正确的 ＣｏＮＡＣ５
迫下表达模式差异及其可能参与干旱响应的信号
与 ＣｏＮＡＣ７９ 基因编码氨基酸序列的理化性质进行
途径ꎮ 本研究旨在为深入探究油茶响应干旱胁迫
在线分析ꎬ利用 ＤＮＡＭＡＮ 软件将油茶 ＣｏＮＡＣ５ 与
分子调控网络提供参考ꎬ为油茶抗逆分子育种计
陆地棉( Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍꎬＸＰ＿０１６７３２４８９.２)、君
划提供候选基因ꎮ
迁子 ( Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ ｌｏｔｕｓꎬ ＸＰ ＿ ０５２２０６３２４. １ )、 柿 子
( Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ ｋａｋｉꎬ ＡＺＬ ＿ １９４０２. １ )、 胡 桃 ( Ｊｕｇｌａｎｓ
１ 材料与方法 ｒｅｇｉａꎬＸＰ＿０１８８５１４４５.１) 等序列ꎬＣｏＮＡＣ７９ 与荔枝

(Ｌｉｔｃｈｉ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓꎬＵＫＦ＿１８６７１.１)、猕猴桃( Ａｃｔｉｎｉｄｉａ
１.１ 试验材料、生长条件以及胁迫处理
ｃｈｉｎｅｎｓｉｓꎬＱＱＧ ＿ ６４０９５. １)、 柑 橘 ( Ｃｉｔｒｕｓ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａꎬ
选取长势一致的两年生“长林 １８”油茶嫁接苗
ＡＹＣ＿３５３８３.１)、马铃薯( Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍꎬＡＴＤ＿
为试验材料ꎬ在江西农业大学林学院校内实践基 ５０２１６.１)等序列进行比对ꎬ并利用 ＴＢｔｏｏｌｓ 软件构
地(２８°４６′ Ｎ、１１５°５５′ Ｅ)温室大棚开展盆栽试验ꎮ 建进化树和保守基序ꎮ
采用水 培 法ꎬ 将 油 茶 根 部 浸 润 在 ３０％ 聚 乙 二 醇 １.４ ＥＧＦＰ￣ＣｏＮＡＣ５ 和 ＥＧＦＰ￣ＣｏＮＡＣ７９ 的载体构
(ＰＥＧ６０００)溶液中模拟干旱ꎻＡＢＡ 处理则采用叶 建及亚细胞定位
面喷施法ꎬ在油茶叶面喷洒浓度为 ２００ ｎｇｍＬ 的 使用 ＳｎａｐＧｅｎｅ 软 件 设 计 同 源 重 组 引 物 ＣＺ￣
￣１
ＡＢＡ 溶液ꎮ 于 １２、２４、３６、４８ ｈ 采集各处理和对照 ＥＣｏＮＡＣ５￣Ｆ / Ｒ 和 ＣＺ￣ＥＣｏＮＡＣ７９￣Ｆ / Ｒ( 表 １)ꎬ以油
®
的嫩叶ꎬ每个处理设置 ３ 次重复ꎮ 采集根、茎、叶、 茶 ｃＤＮＡ 为模板进行扩增ꎬ利用 ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａ
花、幼果、种仁各部位材料ꎬ置于液氮中速冻ꎬ－ ８０ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ( Ｃ１１５ꎬ诺唯赞) 同源重组酶ꎬ
℃ 保存备用ꎮ 构建 ＥＧＦＰ￣ＣｏＮＡＣ５ 与 ＥＧＦＰ￣ＣｏＮＡＣ７９ 植物表达