Page 89 - 《广西植物》2024年第12期
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１２ 期 赵娜红等: 油茶两个响应干旱 ＮＡＣ 转录因子的克隆、亚细胞定位及自激活检测 ２ ２ ４ ７
６４０９５.１)和柑橘( Ｃｉｔｒｕｓ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａꎬＡＹＣ＿３５３８３.１)ꎬ
相似度分别达 ８４.２２％、８０.４６％和８０.２９％(图 ３)ꎮ
２.３ ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９ 基因的亚细胞定位
构 建 ＥＧＦＰ￣ＣｏＮＡＣ５ 和 ＥＧＦＰ￣ＣｏＮＡＣ７９ 表 达
载 体ꎬ 以 ３５Ｓ￣ＥＧＦＰ￣ＣｏＮＡＣ５ 和 ３５Ｓ￣ＥＧＦＰ￣
ＣｏＮＡＣ７９ 为核定位标记ꎬ并将其注射到烟草原生
质体中ꎮ 结果在烟草原生质质体的细胞核中检测
到绿色荧光ꎬ其在相同位置与核定位标记共表达ꎬ
证明 ＣｏＮＡＣ５ 与 ＣｏＮＡＣ７９ 蛋白均定位在细胞核中
(图 ４)ꎮ
２.４ ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９ 基因的自激活活性测定
ＮＡＣ 转录因子含有保守的 Ｎ 端 ＤＮＡ 结合结
构域和 Ｃ 端激活结构域ꎮ 将 ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９
的 ＣＤＳ 序列分别克隆到 ＰＧＢＫＴ￣７ 载体中ꎬ并转化
到 Ｙ２Ｈ 酵 母 菌 中ꎬ 阳 性 对 照 分 别 为 ｐＧＡＤＴ７￣Ｔ、
ｐＧＢＫＴ７￣Ｐ５３ꎬＡＤ 与 ＢＤ 空载转入酵母菌作为阴性
对照ꎬ所有这些酵母菌在 ＳＤ / ￣Ｌｅｕ￣ＴｒＰ 培养基上生
长良好ꎬ但只有阳性对照在 ＳＤ / ￣Ｌｅｕ￣Ｔｒｐ￣Ｈｉｓ￣Ａｄｅ
图 １ 油茶 ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９ 基因的克隆
生长良好(图 ５)ꎮ
Ｆｉｇ. １ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ＣｏＮＡＣ５ ａｎｄ ＣｏＮＡＣ７９ ｇｅｎｅｓ
２.５ ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９ 结构域自激活分析
ｉｎ Ｃａｍｅｌｌｉａ ｏｌｅｉｆｅｒａ
含有 ｐＧＢＫＴ７￣ＣｏＮＡＣ５￣Ｎ 和 ｐＧＢＫＴ７￣ＣｏＮＡＣ５￣
Ｃ 以及 ｐＧＢＫＴ７￣ＣｏＮＡＣ７９￣Ｎ 和 ｐＧＢＫＴ７￣ＣｏＮＡＣ７９￣
电 残 基 的 数 量 分 别 为 ３４ 和 ３７ꎬ 分 子 式 为 Ｃ 载体质粒的酵母菌在 ＳＤ / ￣Ｌｕｅ￣Ｔｒｐ 均能正常生
Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ Ｓ ꎬ蛋白的不稳定系数为 ３７. ４７ꎬ 长ꎬ 但 含 有 ｐＧＢＫＴ７￣ＣｏＮＡＣ５￣Ｎ 和 ｐＧＢＫＴ７￣
１６７０ ２５３５ ４５３ ４９９ ８
为稳定性蛋白ꎻ脂溶性指数为 ６２.７２ꎬ平均亲水系 ＣｏＮＡＣ７９￣Ｎ 载 体 质 粒 的 酵 母 菌 在 ＳＤ / ￣Ｌｅｕ￣Ｔｒｐ￣
数为－０.６０５ꎬ为亲水性蛋白ꎮ Ｈｉｓ￣Ａｄｅ 无法正常生长ꎬ说明 ＣｏＮＡＣ５ 与 ＣｏＮＡＣ７９
２.２.１ ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９ 的系统发育进化树、保 的 Ｎ 端 不 存 在 转 录 激 活 活 性ꎻ 含 有 ｐＧＢＫＴ７￣
守基序分析 将 ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９ 氨基酸序列 ＣｏＮＡＣ５￣Ｃ 与 ｐＧＢＫＴ７￣ＣｏＮＡＣ７９￣Ｃ 载 体 质 粒 的 酵
与多个同源氨基酸构建进化树ꎬ发现其分别与柿 母菌在 ＳＤ / ￣Ｌｅｕ￣Ｔｒｐ￣Ｈｉｓ￣Ａｄｅ 可以正常生长ꎬ说明
子和荔枝聚在同一分支ꎬ同源性比较高ꎮ ＣｏＮＡＣ５ ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９ 的 Ｃ 端 存 在 转 录 激 活 活 性
和 ＣｏＮＡＣ７９ 都具有保守基序ꎬ通过 ＳｎａｐＧｅｎｅ 软件 (图 ６)ꎮ
构建进化树和保守基序(图 ２)ꎮ ２.６ ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９ 基因的表达模式分析
２.２.２ ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９ 同源序列比对 通过 对不同组织表达特异性分析发现ꎬＣｏＮＡＣ５ 和
ＭＥＧＡ ７. ０ 软 件ꎬ 选 用 邻 接 法ꎬ 对 ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９ 在油茶根、茎、叶、花、幼果和种仁 ６ 个组
ＣｏＮＡＣ７９ 的同源氨基酸序列进行多序列比对ꎬ运 织中都有表达ꎬ其中均在根和种仁中表达较高ꎬ在
用 ＢＬＡＳＴｐ 程序搜索油茶 ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９ 氨 花中表达最低( 图 ７)ꎮ ＣｏＮＡＣ５ 在根中的表达量
基酸序列的同源序列ꎬ发现与 ＣｏＮＡＣ５ 相似度最 是花的 １１１ 倍ꎬ是茎的 ９０ 倍ꎬ是叶的 ２８ 倍ꎬ是幼果
高的分别为柿子(Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ ｋａｋｉꎬＡＺＬ＿１９４０２.１)ꎬ其 的 １４ 倍ꎬ是种仁的 １.２ 倍ꎮ ＣｏＮＡＣ７９ 在种仁中的
次为君迁子(Ｄ. ｌｏｔｕｓꎬＸＰ＿０５２２０６３２４.１) 和陆地棉 表达量是花的 ５８０ 倍ꎬ是茎的 ４８０ 倍ꎬ是叶的 ８１
(Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍꎬＸＰ＿０１６７３２４８９.２)ꎬ相似度分 倍ꎬ是幼果的 ７０ 倍ꎬ是根的 ５ 倍ꎮ
别达 ８２.４８％、７９.５３％ 和 ７８.７５％ꎻ与 ＣｏＮＡＣ７９ 相 在 ＰＥＧ 模 拟 干 旱 胁 迫 中ꎬ 不 同 时 间 段 下
似度最高的为荔枝( Ｌｉｔｃｈｉ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓꎬＵＫＦ＿１８６７１.１ ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９ 的表达与对照相比ꎬ均存在显
)ꎬ 其 次 为 猕 猴 桃 ( Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓꎬ ＱＱＧ ＿ 著差异(图 ８)ꎮ ＰＥＧ 处理 ３６ ｈꎬＣｏＮＡＣ５ 的表达量
