Page 88 - 《广西植物》2024年第12期
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２ ２ ４ ６ 广 西 植 物 ４４ 卷
载体ꎮ 提取含有增强绿色荧光蛋白 ＥＧＦＰ 的植物 ４１７ ~ １ ０４４ ｂｐ、４１７ ~ ９９０ ｂｐ 构建 Ｃ 端 ｐＧＢＫＴ７￣Ｃ
表达载体质粒ꎬ在 ３７ ℃ 下 ｋｐｎ Ｉ 酶切 １ ｈꎬ纯化后 载体ꎬ并分别转到 Ｙ２Ｈ 酵母菌中进行筛选和检测ꎮ
使用同源重组酶ꎬ５０ ℃ 下连接 １５ ｍｉｎꎬ转化至大肠 挑取转化成功 的 ｐＧＢＫＴ７￣ＣｏＮＡＣ５￣Ｎ 和 ｐＧＢＫＴ７￣
杆菌 ＤＨ５αꎬ并涂布在含有卡纳抗性和氨苄抗性的 ＣｏＮＡＣ５￣Ｃ 以 及 ｐＧＢＫＴ７￣ＣｏＮＡＣ７９￣Ｎ 和 ｐＧＢＫＴ７￣
ＬＢ 培养基上ꎮ 挑选单菌落进行 ＰＣＲ 验证ꎬ将阳性 ＣｏＮＡＣ７９￣Ｃ 酵母单菌落ꎬ稀释重悬ꎬ调整菌液浓度
克隆委托生工生物工程( 上海) 股份有限公司测 并点涂观察ꎮ
序ꎬ比对测序结果并保菌ꎮ 对含有 ＥＧＦＰ￣ＣｏＮＡＣ５ １.８ ｑＲＴ￣ＰＣＲ 引物设计及其验证
与 ＥＧＦＰ￣ＣｏＮＡＣ７９ 载体的大肠杆菌提取质粒ꎬ并 通 过 ＳｎａｐＧｅｎｅ 软 件 设 计 ｑＰＣＲ 引 物 ＤＬ￣
转化到 ＧＶ３１０１ 农杆菌中ꎬ将农杆菌注射到健康生 ＣｏＮＡＣ５￣Ｆ / Ｒ 与 ＤＬ￣ＣｏＮＡＣ７９￣Ｆ / Ｒꎬ内参为 ＥＦ￣１α￣
长的烟草叶片中ꎬ培养 ２ ｄꎬ用激光共聚焦显微镜 Ｆ / Ｒ ( 表 １ )ꎮ 采 用 ２５ μＬ 反 应 体 系: ＣｈａｍＱ
(ＦＶ３０００ꎬＯｌｙｍｐｕｓ)观察 ＥＧＦＰ 在烟草细胞中的分 Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ( Ｑ７１１￣０２ꎬ 诺 唯
￣１
布情况ꎮ 赞) １２.５ μＬꎬｃＤＮＡ 模板 ２.５ μＬꎬ１０ μｍｏｌＬ 上下
１. ５ ｐＧＢＫＴ７￣ＣｏＮＡＣ５ 和 ｐＧＢＫＴ７￣ＣｏＮＡＣ７９ 的 游引物各 １.５ μＬꎬｄｄＨ Ｏ ７ μＬꎮ 荧光定量仪反应
２
载体构建 程序:９５ ℃ ２ ｍｉｎꎬ９５ ℃ ５ ｓꎬ６０ ℃ ３０ ｓꎬ９５ ℃ ５ ｓꎬ
使 用 ＣＺ￣ＢＤＣｏＮＡＣ５￣Ｆ / Ｒ 和 ＣＺ￣ＢＤＣｏＮＡＣ７９￣ ４０ 个循环ꎻ９５ ℃ ５ ｓꎻ６５ ℃ ５ ｓꎬ９５ ℃ ５ ｓꎮ 每个样
Ｆ / Ｒ 引 物 ( 表 １ )ꎬ 以 油 茶 ｃＤＮＡ 为 模 板ꎬ 构 建 品进行 ３ 次生物学重复ꎮ 反应完成后ꎬ用 ２ －ΔΔ Ｃｔ 对
ｐＧＢＫＴ７￣ＣｏＮＡＣ５ 与 ｐＧＢＫＴ７￣ＣｏＮＡＣ７９ 载 体ꎮ 提 ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９ 基因的表达量进行计算ꎮ
取 ｐＧＢＫＴ７ 载体质粒ꎬ在 ３７ ℃ 下使 用 ＥｃｏＲ Ｉ 和 １.９ 数据处理
ＢａｍＨ Ｉ 双酶切 １ ｈꎬ纯化后使用同源重组酶在 ５０ 使用 ＳＰＳＳ ２２.０ 软件的 Ｄｕｎｃａｎ 法进行显著性
℃ 下连接 １５ ｍｉｎꎬ转化大肠杆菌 ＤＨ５α 中ꎬ并涂布 分析ꎬ用 Ｏｒｉｇｉｎ ２０２１ 软件作图ꎮ
在含有卡纳霉素的新鲜 ＬＢ 固体培养基上ꎬ对单菌
落进行 ＰＣＲ 检验并送至生工生物工程( 上海) 股 ２ 结果与分析
份有限公司测序ꎬ比对测序结果并保菌ꎮ
１.６ 酵母的转化及酵母自激活活性分析 ２.１ ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９ 基因的克隆
使用质粒提取试剂盒ꎬ从测序正确的大肠杆菌 提取油茶叶片总 ＲＮＡꎬ纯化后获得 ｍＲＮＡꎬ反
中提 取 ｐＧＢＫＴ７￣ＣｏＮＡＣ５ 和 ｐＧＢＫＴ７￣ＣｏＮＡＣ７９ 质 转录成 ｃＤＮＡꎮ 以 ｃＤＮＡ 为模 板 扩 增 ＣｏＮＡＣ５ 和
粒ꎬ并转化到 Ｙ２ＨＧｏＩｄ 酵母菌株中ꎬ涂布在 ＳＤ/ ￣ ＣｏＮＡＣ７９ 序列ꎬ得到约 １ ０００ ｂｐ 的扩增产物( 图
Ｌｅｕ￣Ｔｒｐ 固体培养基上ꎬ并放置于 ２８ ℃ 培养箱 ２ ~ ３ １)ꎬ切胶回收ꎮ 将纯化后的片段连接至 ｐＭＤ１９￣Ｔ
ｄꎬ以 ｐＧＡＤＴ７ 为阴性对照ꎬ以 ｐＧＡＤＴ７￣Ｔ 和 ｐＧＢＫＴ￣ 载体上ꎬ挑取阳性克隆摇菌ꎬ将菌液送至生工生物
Ｐ５３ 为 阳 性 对 照ꎬ ＰＣＲ 检 测 阳 性 单 菌 落 后 保 存 工程(上海)股份有限公司测序ꎮ 测序结果比对得
ｐＧＢＫＴ７￣ＣｏＮＡＣ５ 和 ｐＧＢＫＴ７￣ＣｏＮＡＣ７９ 酵母菌株ꎮ 出 ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９ 序 列 长 度 为 １ ０４４ ｂｐ 和
挑 取 成 功 转 化 的 ｐＧＢＫＴ７￣ＣｏＮＡＣ５ 和 ９９０ ｂｐꎬ片 段 长 度 与 ＰＣＲ 扩 增 反 应 结 果 ( 图 １)
ｐＧＢＫＴ７￣ＣｏＮＡＣ７９ 酵母单克隆菌株ꎬ稀释重悬ꎬ将 相符ꎮ
菌液浓度 ＯＤ６００ 调整到 ０.０２、０.００２ 和 ０.０００ ２ꎬ吸 ２.２ ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９ 基因的生物信息学分析
取 ５ μＬ 浓度梯度点涂于 ＳＤ / ￣Ｌｅｕ￣Ｔｒｐ 和 ＳＤ / ￣Ｌｅｕ￣ 通 过 在 线 分 析 网 站 Ｅｘｐａｓｙ￣ＰｒｏｔＰａｒａｍ 分 析
Ｔｒｐ￣Ｈｉｓ￣Ａｄｅ 酵母培养基上ꎬ在 ２８ ℃ 培养箱中培养 ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９ 蛋白的理化性质ꎮ ＣｏＮＡＣ５ 编
２ ~ ３ ｄꎬ观察诱饵菌株的生长状况ꎮ 码氨基酸数量 ３４８ꎬ相对分子量为 ３９ １１４.９２ Ｄａꎬ理
１. ７ ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９ 结构域的酵母自激活 论等电点为 ８.８６ꎬ呈碱性ꎻ带正负电残基的数量分别
分析 为 ３５ 和 ４０ꎬ分子式为Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ Ｓ ꎬ蛋白的不
１７４３ ２６７３ ４８３ ５２５ １０
ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９ 是典型的 ＡＴＮＡＣ３￣ＮＡＣ 稳定系数为 ４１.３５ꎬ为不稳定蛋白ꎻ脂溶性指数为
转录因子ꎬ在 Ｎ 端均含有一段保守结构域且在 Ｃ ６５.２９ꎬ平 均 亲 水 系 数 为 － ０. ６１７ꎬ为 亲 水 性 蛋 白ꎮ
端具有转录激活活性ꎮ 本研究以位于 ＣｏＮＡＣ５ 和 ＣｏＮＡＣ７９ 编 码 氨 基 酸 数 量 ３３０ꎬ 相 对 分 子 量
ＣｏＮＡＣ７９ Ｎ 端 １ ~ ４１７ ｂｐ 构建 ｐＧＢＫＴ７￣Ｎ 载体ꎬ以 ３７ １９８.７１ Ｄａꎬ理论等电点为 ８.５７ꎬ呈碱性ꎻ带正负
