Page 101 - 《广西植物》2024年第7期

７ 期 李雅暄等: 不同山茶种质组培条件下染色体倍性的维持与变化 １ ３ ０ １

表 １ 山茶属不同种质、采集地点及外植体来源
１ 材料与方法 Ｔａｂｌｅ １ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓꎬ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ａｎｄ
ｅｘｐｌａｎｔ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ Ｃａｍｅｌｌｉａ
１.１ 试验材料和采样 种质 采集地点 外植体来源
Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｌｏｃａｔｉｏｎ Ｅｘｐｌａｎｔ ｓｏｕｒｃｅ
所使用的山茶种质采自中国林业科学研究院
亚热带林业研究所山茶种质资源圃以及金华山茶 单体红山茶 金华山茶物种园 花芽、嫩叶
Ｊｉｎｈｕａ Ｃａｍｅｌｌｉａ
Ｃａｍｅｌｌｉａ ｕｒａｋｕ Ｆｌｏｗｅｒ ｂｕｄꎬ ｌｅａｆｌｅｔ
物种园ꎬ采样时间为 ２０２１ 年 ７—８ 月ꎬ样品类型为嫩 Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｇａｒｄｅｎ
金华山茶物种园
叶、花芽等组织(表 １)ꎮ 具体的种质信息如下:单体 浙江红山茶 花芽、嫩叶
Ｃ. ｃｈｅｋｉａｎｇｏｌｅｏｓａ Ｊｉｎｈｕａ Ｃａｍｅｌｌｉａ Ｆｌｏｗｅｒ ｂｕｄꎬ ｌｅａｆｌｅｔ
红 山 茶 ( Ｃａｍｅｌｌｉａ ｕｒａｋｕ )、 浙 江 红 山 茶 ( Ｃ. Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｇａｒｄｅｎ
Ｃｈｅｋｉａｎｇｏｌｅｏｓａ)、滇山茶(Ｃ. ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ)、大花红山茶 滇山茶 金华山茶物种园 花芽
Ｊｉｎｈｕａ Ｃａｍｅｌｌｉａ
(Ｃ. ｍａｇｎｉｆｌｏｒａ)、峨眉红山茶(Ｃ. ｏｍｅｉｅｎｓｉｓ)、全缘红 Ｃ. ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｇａｒｄｅｎ Ｆｌｏｗｅｒ ｂｕｄ
山 茶 ( Ｃ. ｓｕｂｉｎｔｅｇｒａ )、 山 手 ( Ｃ. ｊａｐｏｎｉｃａ 大花红山茶 金华山茶物种园 种子
‘Ｓｈａｎｓｈｏｕ’)、南山茶( Ｃ. ｓｅｍｉｓｅｒｒａｔａ)、尖萼红山茶 Ｃ. ｍａｇｎｉｆｌｏｒａ Ｊｉｎｈｕａ Ｃａｍｅｌｌｉａ Ｓｅｅｄ
Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｇａｒｄｅｎ
(Ｃ. ｅｄｉｔｈａｅ)、金蝶飞叶(Ｃ. ｊａｐｏｎｉｃａ ‘Ｊｉｎｄｉｅｆｅｉｙｅ’)ꎮ 金华山茶物种园
峨眉红山茶 花芽、嫩叶
１.２ 山茶种质愈伤组织的培养 Ｃ. ｏｍｅｉｅｎｓｉｓ Ｊｉｎｈｕａ Ｃａｍｅｌｌｉａ Ｆｌｏｗｅｒ ｂｕｄꎬ ｌｅａｆｌｅｔ
Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｇａｒｄｅｎ
前期采集获得了 １０ 种山茶种质的样品ꎬ经过
全缘红山茶 金华山茶物种园 花芽、嫩叶
自来水冲洗和外植体消毒后ꎬ使用 ＭＳ￣Ｄ２ 培养基 Ｃ. ｓｕｂｉｎｔｅｇｒａ Ｊｉｎｈｕａ Ｃａｍｅｌｌｉａ Ｆｌｏｗｅｒ ｂｕｄꎬ ｌｅａｆｌｅｔ
Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｇａｒｄｅｎ
诱导愈伤组织ꎮ ＭＳ￣Ｄ２ 培养基配方如下:琼脂 ６.５
南山茶 金华山茶物种园 花芽、嫩叶
￣１ ￣１
ｇＬ 、蔗糖 ３０ ｇＬ 、ＭＳ 培养基粉末 ４.４３ ｇ Ｊｉｎｈｕａ Ｃａｍｅｌｌｉａ
Ｃ. ｓｅｍｉｓｅｒｒａｔａ Ｆｌｏｗｅｒ ｂｕｄꎬ ｌｅａｆｌｅｔ
Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｇａｒｄｅｎ
￣１ ￣１ ￣１
Ｌ 、ＮＡＡ ０.５ ｍｇＬ 、２ꎬ４￣Ｄ ０.５ ｍｇＬ 、６ＢＡ １
金华山茶物种园
￣１ ￣１ 尖萼红山茶 花芽
ｍｇＬ 、椰汁 ５０ ｍＬＬ ꎮ 外植体消毒流程如下: Ｊｉｎｈｕａ Ｃａｍｅｌｌｉａ
Ｃ. ｅｄｉｔｈａｅ Ｆｌｏｗｅｒ ｂｕｄ
使用 ７５％酒精浸泡并摇动外植体ꎬ使充分接触 ２ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｇａｒｄｅｎ
ｍｉｎꎻ用灭菌后的纯水冲洗 ２ 次后ꎬ使用 ５％次氯酸 中国林业科学研究
山手 院亚热带林业研究 花芽
钠消毒 １０ ｍｉｎꎻ剥离外部已褐化的外层苞片后、切 Ｃ. ｊａｐｏｎｉｃａ 所山茶资源圃
‘Ｓｈａｎｓｈｏｕ’ ＲＩＳＦꎬ Ｃａｍｅｌｌｉａ Ｆｌｏｗｅｒ ｂｕｄ
开并接种进培养基ꎮ 经暗培养约 １ 个月后ꎬ待脱 Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｇａｒｄｅｎ
分化的愈伤组织长到约 ０.５ ｃｍ × ０.５ ｃｍ 大小后ꎬ 中国林业科学研究
金蝶飞叶 院亚热带林业研究
将已褐化的原外植体切除后ꎬ移入组织培养瓶中 Ｃ. ｊａｐｏｎｉｃａ 所山茶资源圃 花芽
进行光照培养ꎬ条件为 １２ ｈ 光 / １２ ｈ 暗、光照强度 ‘Ｊｉｎｄｉｅｆｅｉｙｅ’ ＲＩＳＦꎬ Ｃａｍｅｌｌｉａ Ｆｌｏｗｅｒ ｂｕｄ
Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｇａｒｄｅｎ
４ ０００ ｌｘ、温度(２５±２)℃ ꎮ
注: ＲＩＳＦ. 中国林业科学研究院亚热带林业研究所ꎮ
１.３ 山茶种质愈伤组织的流式细胞仪分析
Ｎｏｔｅ: ＲＩＳＦ. Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ Ｆｏｒｅｓｔｒｙꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ
(１)取适量愈伤组织(０.１ ~ ０.２ ｇ) 放入 ３.５ ｃｍ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ.
培养皿中ꎬ培养皿中放入 ２ ｍＬ 的细胞裂解液( Ｔｒｉｓ
￣１ ￣１ １.４ 山茶组织秋水仙素处理和培养
２００ ｍｍｏｌ Ｌ 、 ＭｇＣｌ ４ ｍｍｏｌ Ｌ 、 Ｔｒｉｔｏｎ ０. ５％ꎬ
２
ｐＨ ７.５)ꎬ用锋利的刀片切成小块后冰上放置约 １５ 依据秋水仙素设定的处理浓度ꎬ配置 ＣＳ４ 培
￣１
ｍｉｎꎮ (２) 使用移液枪吸取塑料培养皿中的上清 养基(琼脂 ６.５ ｇＬ 、蔗糖 ３０ ｇＬ 、ＭＳ 培养基
￣１
￣１
液ꎬ将上清液经过孔径 ４０ μｍ 的尼龙滤膜过滤ꎬ转 粉末 ４.４３ ｇＬ 、ＴＤＺ １ ｍｇＬ 、ＰＡＡ １５ ｍｇＬ 、
￣１
￣１
移至 ２ ｍＬ 的圆底塑料管中ꎬ并做好标记ꎮ 根据滤 ＮＡＡ ０.３ ｍｇＬ 、椰汁 ５０ ｍＬＬ )ꎬ并对耐冬愈
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￣１
液体积ꎬ 加 入 １ / １００ 体 积 的 ＰＩ 染 料 ( １００ ｍｇ 伤组织进行培养ꎮ 秋水仙素浓度分别为 １０、２０、３０
￣１
Ｌ )ꎬ轻轻混匀后用锡箔纸封闭ꎬ置于冰上保存至 ｍｇＬ ꎬ处理时间为 １０、１５、２０ ｄꎬ处理完成后转入
￣１
上机检测ꎮ (３) 使用 ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ 流式细胞仪对 不含秋水仙素的 ＣＳ４ 培养基中ꎬ利用流式细胞仪
山茶愈伤组织以及诱导后的组织进行倍性测量ꎬ 测定 ＤＮＡ 含量并估算染色体倍性ꎮ 为了快速检
使用 ＦＬ２￣Ａ 作为 ｘ 轴ꎬＳＳＣ￣Ｈ 作为 ｙ 轴对测定值进 测处理效果ꎬ倍性检测首先采用混测法ꎬ即将 ５ ~ ６
行分析ꎮ 个愈伤组织混合检测ꎬ根据倍性变化结果对每个