Page 91 - 《广西植物》2024年第7期

７ 期 马洪宇等: 大豆膨胀素基因 ＧｍＥＸＰＢ５ 和 ＧｍＥＸＰＢ７ 生物信息学及表达分析 １ ２ ９ １

程中易受高盐、干旱和低温等非生物胁迫的危害ꎬ １.２.２ 大豆幼苗非生物胁迫处理 选择大小一致、
它们不仅影响大豆的生长发育ꎬ还影响其产量和品 饱满的大豆种子ꎬ于 ２０２２ 年 １０ 月均匀播撒在盛
质(盖钧镒ꎬ２００３ꎻ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００３)ꎮ 因此ꎬ大豆 满无菌土的介质中ꎬ覆膜管理ꎮ 待种子萌发ꎬ根长
抗逆基因的挖掘对于大豆抗性品种的选育具有十 至 ６ ~ ８ ｃｍ 时移入 Ｈｏａｇｌａｎｄ 营养液中培养ꎬ期间
分重要的意义ꎮ 目前ꎬＥＸＰＢ 基因与植物抗逆性的 ２ ~ ３ ｄ 更换一次营养液ꎮ 待幼苗长至第 １ 片三出
相关研究大多集中于禾本科作物ꎮ 大豆中仅发现 复叶完全展开时对其分别进行盐、干旱和低温胁
ＧｍＥＸＰＢ２ 在非生物胁迫环境下与根系统的形态建 迫处理ꎮ 盐胁迫处理时将幼苗放入 ＮａＣｌ 终浓度
成密切相关(Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１１)ꎮ 鉴于 ＥＸＰＢ 基因的 为 ２５０ ｍｍｏＬＬ 的营养液中ꎻ将幼苗放置在终浓
￣１
研究可能对大豆抗逆性的改良及产量的提高发挥 度为 ２０％ ＰＥＧ８０００ 的营养液中模拟干旱胁迫处
积极作用ꎬ而转录因子家族基因的功能又存在冗余 理ꎻ低温处理时将幼苗放置于 ４ ℃ 恒温培养箱中ꎮ
性ꎬ因此有必要对大豆 ＥＸＰＢ 家族中的关键抗逆基 将未经处理的 ０ ｈ 以及胁迫处理后的 １、２、５、１０、
因进行进一步的筛选和鉴定ꎮ 本研究从大豆 ＥＸＰＢ ２４ ｈ 设置为取样时间点ꎬ在每个时间点分别取称
基因家族中选取 ＧｍＥＸＰＢ５ 和 ＧｍＥＸＰＢ７ 进行生物 ０.１ ｇ 第 １ 片三出复叶并于液氮中速冻ꎮ 此外ꎬ分
信息学分析ꎬ并对其在大豆根、茎、叶及非生物胁迫 别称取 ０.１ ｇ 未处理的根和茎于液氮中速冻ꎮ 所
处理下的表达量进行检测ꎬ为大豆 ＥＸＰＢ 基因抗逆 取样品材料均保存在－８０ ℃ 超低温冰箱中ꎮ
机制的研究及应用提供理论依据ꎮ １.２.３ ＲＮＡ 的提取及 ｃＤＮＡ 合成 利用 ＴａＫａＲａ 公
司的 ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ 试剂分别提取上述各样本的总
１ 材料与方法 ＲＮＡꎻ使用 Ｉｎｎｏｖａｇｅｎｅ 公司的反转录试剂盒合成
ｃＤＮＡ 第一链ꎬ－２０ ℃ 冻存ꎮ
１.１ 试验材料 １.２. ４ 实 时 荧 光 定 量 ＰＣＲ ( ｑＲＴ￣ＰＣＲ) 利 用
所用试验材料为黑龙江省西部地区广泛种植 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５. ０ 软 件ꎬ 根 据 ＧｍＥＸＰＢ５ 和
的耐旱大豆品种‘ 克山 １ 号’ꎬ由黑龙江省农业科 ＧｍＥＸＰＢ７ 的 ｃＤＮＡ 序 列 设 计 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 引 物ꎮ
学院克山分院提供ꎮ ｑＲＴ￣ＰＣＲ 内 参 基 因 选 取 大 豆 Ｇｍβ￣Ｔｕｂｕｌｉｎ 基 因
１.２ 试验方法 (Ｑｉｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０)ꎮ ３ 对 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 引物序列如表
１.２.１ 生物信息学分析 从 ＮＣＢＩ 数据库( ｈｔｔｐｓ: / / １ 所示ꎬ引物由长春生工生物公司合成ꎮ 以各样品
ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / ) 中下载大豆 ＧｍＥＸＰＢ５ 和 的 ｃＤＮＡ 为 模 版ꎬ 使 用 Ｉｎｎｏｖａｇｅｎｅ 公 司 的 ２ × Ｔａｑ
ＧｍＥＸＰＢ７ 的基因编码序列及蛋白质氨基酸序列ꎻ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ 试剂盒ꎬ在 ＢＩＯ￣ＲＡＤ ＣＦＸ９６
使用在线网站 ＰｒｏｔＰａｒａｍ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / Ｒｅａｌ￣Ｔｉｍｅ ＰＣＲ 仪上ꎬ对 ＧｍＥＸＰＢ５ 和 ＧｍＥＸＰＢ７ 在
ｐｒｏｔｐａｒａｍ / )进行蛋白质的基本理化性质分析ꎻ利 根、茎、叶及非生物胁迫下的表达量进行 ｑＲＴ￣ＰＣＲ
用在 线 网 站 ＰＳＯＲＴ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ. ｃｏｍ / 检测ꎮ ｑＲＴ￣ＰＣＲ 的 程 序 设 置 和 体 系 参 照 Ｑｉｕ 等
ｔｏｏｌｓ/ ｐｓｏｒｔ)预测蛋白质的亚细胞定位ꎻ利用在线网 (２０２０)ꎬ所有处理均采用 ３ 次重复ꎬ以 ２ －ΔΔＣｔ 法计
站 ＳＭＡＲＴ(ｈｔｔｐｓ: / / ｓｍａｒｔ.ｅｍｂｌ￣ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ.ｄｅ / )分析 算 ＧｍＥＸＰＢ５ 和 ＧｍＥＸＰＢ７ 的基因相对表达量ꎮ
预测蛋白质序列的保守结构域及所在位置ꎻ使用
ＤＮＡＭＡＮ ８ 软件进行蛋白质序列比对ꎻ利用在线 ２ 结果与分析

网 站 ＭＥＭＥ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｍｅｍｅ￣ｓｕｉｔｅ. ｏｒｇ / ｍｅｍｅ / ｔｏｏｌｓ/
ｍｅｍｅ)预测蛋白质保守基序( Ｍｏｔｉｆ)ꎻ使用在线数 ２.１ ＧｍＥＸＰＢ５ 和 ＧｍＥＸＰＢ７ 基因及蛋白序列分析

据 库 Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ￣ｎｅｘｔ. ｊｇｉ. ｄｏｅ. ２.１. １ ＧｍＥＸＰＢ５ 和 ＧｍＥＸＰＢ７ 基 本 理 化 性 质 分
ｇｏｖ / ｂｌａｓｔ￣ｓｅａｒｃｈ ) 搜 索 并 下 载 ＧｍＥＸＰＢ５ 和 析 从 ＮＣＢＩ 数据库中获取两个功能未被鉴定的
ＧｍＥＸＰＢ７ 的 启 动 子 序 列ꎬ 并 利 用 在 线 软 件 大豆 ＥＸＰＢ 基因ꎬ即 ＧｍＥＸＰＢ５( ＧｅｎＢａｎｋ 登录号:

ＰｌａｎｔＣＡＲＥ ( ｈｔｔｐ: / / ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ｐｓｂ. ｕｇｅｎｔ. ｂｅ / ＮＭ００１２６１４３３) 和 ＧｍＥＸＰＢ７ ( ＧｅｎＢａｎｋ 登 录 号:
ｗｅｂｔｏｏｌｓ/ ｐｌａｎｔｃａｒｅ / ｈｔｍｌ/ ) 预 测 ＧｍＥＸＰＢ５ 和 ＮＭ００１２６７０６９ )ꎮ 如 表 ２ 所 示ꎬ ＧｍＥＸＰＢ５ 和
ＧｍＥＸＰＢ７ 启动子中的顺式作用元件ꎻ利用 ＭＥＧＡ ＧｍＥＸＰＢ７ 基因分别位于大豆第 １０ 号和第 １２ 号染
７ 软件构建 ＥＸＰＢ 蛋白系统进化树ꎮ 色体上ꎬ 编码的蛋白序列长度分别为 ２７２ 和 ２６７ 个