Page 75 - 《广西植物》2023年第1期
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１ 期 徐碧林等: 蕲艾内生细菌的分离鉴定及抑菌活性分析 ７ １
进行同源性比对( Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７)ꎬ采用 ＭＥＧＡ 材料表面消毒彻底ꎬ分离到的细菌均为蕲艾内部所
７.０ 中的 ＣＬＵＳＴＡＬ＿Ｗ 模块将菌株的 １６ｓ ｒＤＮＡ 序列 有ꎬ而非外界环境污染所致ꎮ 本试验一共从蕲艾的
与其同源关系相近的序列比对分析后ꎬ把两头的序 根、茎和叶中分别分离到 ６、７、７ 株内生细菌ꎮ
列剪 切 整 齐ꎬ 转 换 格 式 后ꎬ 用 ＭＥＧＡ ７. ０ 中 的 ２.２ 筛选菌株总 ＤＮＡ 的提取和 １６ｓ ｒＤＮＡ 扩增结果
Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣Ｊｏｉｎｉｎｇ 模块构建系统进化树ꎬ１ ０００ 次随机 筛选菌株基因组 ＤＮＡ 提取结果见图 １:Ａꎬ基
抽样ꎬ计算自引导值(Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ) 以评估系统进化树 因组 ＤＮＡ 在电泳图上的 ２３ １３０ ｂｐ 附近一条明显
的置信度(Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６)ꎮ 的条带ꎬ可以用于 ＰＣＲ 扩增ꎮ 以基因组 ＤＮＡ 为模
１.２.４ 筛选菌株发酵液挥发物抑菌试验 初筛:将 板ꎬ以及通用引物对 ２７Ｆ / １４９２Ｒꎬ扩增得到了特异
筛选菌株活化并进行平板划线ꎬ挑单菌落于 ３７ ℃ 性长度约为 １ ５００ ｂｐ 的目的条带(图 １:Ｂ)ꎮ
液体培养 １２ ｈꎬ按 １％的接种量接种至 １００ ｍＬＬＢ ２.３ 筛选菌株系统进化分析结果
液体培养基中ꎬ３７ ℃ ꎬ１８０ ｒｍｉｎ ꎬ发酵 ５ ｄꎮ 超 对 ２０ 株内生细菌的 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列进行比对
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声破细胞ꎬ按发酵液:乙酸乙酯 １ ∶ １( Ｖ / Ｖ) 的比例 发现ꎬ来源于叶和茎的内生细菌的 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列
沿着器皿内壁缓慢加入( 防止乳化) 乙酸乙酯ꎬ超 同源性为 １００％ꎬ表明它们共有相同的内生细菌ꎮ
声萃取 ３ 次ꎬ合并 ３ 次得到的萃取液ꎬ用旋转蒸发 将来源于茎和根的 １３ 株内生细菌的基因序列提
仪在 ３５ ℃ 减压条件下浓缩乙酸乙酯相ꎬ定容至 交 到 ＥｚＢｉｏＣｌｏｕｄ 数 据 库 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ.
５００ μＬꎬ４ ℃ 保存备用ꎮ 活化靶标菌后ꎬ挑单菌落ꎬ ｅｚｂｉｏｃｌｏｕｄ. ｎｅｔ/ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ/ １６ｓ ＿ ｄｏｗｎｌｏａｄ) 中 进 行 同
在 ＬＢ 培养基平板上纵横交叉密集划线ꎮ 在密集 源性比对ꎬ查找与其同源性大于 ９９％的菌株ꎬ最终
划线的平板上等距贴直径为 ６ ｍｍ 的灭菌双层滤 确定蕲艾不同组织中的内生细菌归属ꎮ 如表 １ 和
纸片ꎬ每一个滤纸片上滴加 ８ μＬ 内生细菌挥发 图 ２ 所示ꎬ来源于蕲艾茎和叶中共有内生细菌含
油ꎬ每一种内生细菌挥发油做 ３ 组平行试验ꎬ并以 有 ６ 属 ７ 种ꎬ分别为芽孢杆菌属( Ｂａｃｉｌｌｕｓ)２ 株、不
等体积 ０. ３ ｍｇｍＬ 的卡那霉素 作 为 阳 性 对 照 动 杆 菌 属 ( Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ) １ 株、 假 单 胞 菌 属
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( ＋)ꎬ等体积乙酸乙酯作为阴性对照( －)ꎮ 将处理 (Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)１ 株、短小杆菌属( Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ)１
好的平板置于 ４ ℃ 扩散 １ ｄꎬ３７ ℃ 培养 １ ｄ 后ꎬ测 株、黄体 杆 菌 属 ( Ｌｕｔｅｉｂａｃｔｅｒ) １ 株 和 类 节 杆 菌 属
量并计算平均抑菌圈直径 Φꎮ (Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ)１ 株ꎻ来源于蕲艾根的内生细菌
复筛:采用 Ｓｉｌｖａ 描述的方法对筛选菌株发酵液 含有 ３ 属 ６ 种ꎬ分别为芽孢杆菌属( Ｂａｃｉｌｌｕｓ)４ 株、
挥发物的最低抑菌浓度 ( ＭＩＣｓ) 和最低杀菌浓度 肠 杆 菌 属 ( Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ) １ 株 和 干 燥 杆 菌 属
(ＭＢＣｓ)进行了测定(Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１１)ꎮ 用 ＬＢ 培 (Ｓｉｃｃｉｂａｃｔｅｒ)１ 株ꎮ 蕲艾的内生细菌在茎和叶中的
养基对具有显著抑菌效果的菌株发酵液挥发物进 组成几乎相同ꎬ叶和茎与根中的内生细菌种类只
行 ２ 倍梯度稀释(１.０、２.０、４.０、８.０、１６.０、３２.０、６４.０、 共有 １ 个属ꎬ其余都不共有ꎮ
１２８.０、２５６.０、５１２.０ μｇｍＬ )ꎬ用于测定它们最低 ２.４ 筛选菌株的生理生化特征
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抑菌浓度ꎮ 在稀释后的培养液中分别加入 ５０ μＬ 约 对分离获得的 １３ 株内生细菌进行了葡萄糖发
１０ ＣＦＵｍＬ 的对应菌液ꎬ将 ３ 组接种后的菌液置 酵、蔗糖发酵、ＶＰ 试验和产酶等生理生化特征检
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于 ３７ ℃、１８０ ｒｍｉｎ 培养箱培养 ３６ ｈꎮ 培养后完 测(表 ２)ꎬ部分菌株产酶结果见图 ３ꎬ从图 ３:Ａ－Ｃ
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全抑制菌株生长的挥发物的最低浓度即为 ＭＩＣｓꎮ 中可以看出ꎬｌｚｙ￣１７、ｌｚｙ￣２０ 和 ｌｚｙ￣２１ 均能在刚果红
ＭＩＣｓ 实验结束后ꎬ从每一个浓度梯度的试管中取 培养基平板上产生不同大小的水解圈ꎬ表明它们
２００ μＬ 培养物分别涂在 ＬＢ 平板上ꎬ无微生物生长 均能分泌纤维素酶ꎬ其中 ｌｚｙ￣２１ 产纤维素酶能力最
的平板上相应浓度被确定为 ＭＢＣｓꎮ 强ꎬ水解圈与菌落直径比约为 ６.０ꎻ从图 ３:Ｄ￣Ｇ 中
可以看出ꎬｌｚｙ￣１、ｌｚｙ￣９、ｌｚｙ￣１２ 和 ｌｚｙ￣２０ 均能在牛奶
２ 结果与分析 平板上产生不同大小的透明水解圈ꎬ表明它们均
能分泌蛋白酶ꎬ其中 ｌｚｙ￣１ 和 ｌｚｙ￣２０ 产蛋白酶能力
２.１ 蕲艾内生细菌的分离结果 最强ꎬ水解圈与菌落直径比约为 ４.０ꎻ从图 ３:Ｈ 中
最后一次清洗试验材料的无菌水涂布 ＬＢ 平 可以看出ꎬｌｚｙ￣１ 能在含吐温 ８０ 平板上产生与菌落
板ꎬ置于 ３７ ℃培养 １ 周没有微生物生长ꎬ说明试验 直径比约为 ３.５ 的白色晕圈ꎬ 表明其能分泌脂肪
