Page 86 - 《广西植物》2023年第1期
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８ ２ 广 西 植 物 ４３ 卷
引物名称及序列:ＩＴＳ１ (ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴ １、ＰＳＤ￣２、ＰＳＤ￣３ 的分生孢子悬浮液ꎬ３ ｄ 后长出菌
ＧＣＧＧ) / ＩＴＳ４ (ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ)ꎻＥＦ１α￣ 丝ꎬ１ 周后组培苗从根部开始ꎬ朝着茎叶方向发黄ꎬ
ＥＦ ( ＧＣＴＣＣＹＧＧＨＣＡＹＣＧＴＧＡＹＴＴＹＡＴ) / ＥＦ１α￣ＥＲ ２ 周后组培苗全部变黄ꎬ死亡ꎬ而对照组仍无症状ꎮ
( ＡＴＧＡＣＡＣＣＲＡＣＲＧＣＲＡＣＲＧＴＹＴＧ)ꎮ 反 应 体 系 重复试验后获得相同的结果ꎮ
(５０ μＬ):Ｔａｋａｒａ Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ 扩增酶 ４５ μＬꎬ正向引 金铁锁盆栽苗分别接种了病原菌 ＰＳＤ￣１、ＰＳＤ￣
￣１ ￣１ ２、ＰＳＤ￣３ 的分生孢子悬浮液ꎬ１ 个月后ꎬ叶子开始
物(１０ μｍｏｌＬ ) ２ μＬꎬ反向引物(１０ μｍｏｌＬ )
２ μＬꎬＤＮＡ 模板 １ μＬꎮ 反应条件:９８ ℃ 预变性 ２ 萎蔫但没有褪色ꎬ在中午前后光照强、蒸发量大
ｍｉｎꎻ９８ ℃ 变性 １０ ｓꎬＩＴＳ ５６ ℃ ( ＴＥＦ￣１α ５４ ℃ ) 退 时ꎬ植株上部叶片出现萎蔫ꎬ但夜间又能恢复ꎮ 继
￣１ 续观察一段时间后ꎬ叶片萎蔫状况夜间也不能再
火 １０ ｓꎬ７２ ℃ 延伸 (根据片段长度按照 １０ ｓｋｂ
进行设置)ꎬ３０ 个循环ꎻ７２ ℃ 延伸 ５ ｍｉｎꎮ ＰＣＲ 产 恢复ꎬ叶片的绿色逐渐褪去ꎬ直至变成黄白色ꎬ叶
物经凝胶电泳检测后委托擎科生物(上海) 科技有 片开始慢慢脱落ꎮ ２ 个月后ꎬ待叶片完全枯萎脱落
限公司进行测序ꎮ 将测序结果与 ＮＣＢＩ 数据库中 后挖出金铁锁的根ꎬ发现根部颜色比栽种之前更
的已 知 序 列 进 行 ＢＬＡＳＴ 比 对ꎬ 使 用 ＭＥＧＡ ５. ０ 深ꎬ根部软化、腐烂ꎬ与田间患病植株根的症状相
(Ｔａｍｕｒａꎬ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１１)将序列拼接起来ꎬ采用贝叶 同ꎬ而对照组仍无症状ꎮ 重复试验后获得相同的
斯法(Ｂａｙｅｓｉａｎ ＩｎｆｅｒｅｎｃｅꎬＢＩ) 对病原菌进行多基因 结果ꎮ 发病率分别为 ６０％、６１.７％、７１.７％ ( 发病
(ＴＥＦ￣１α 和 ＩＴＳ) 联合建树的方法构建系统发育树 率 ＝ 发病植株 / 植株总数 × １００％)ꎮ 并且ꎬ从发病
( Ｒｏｎｑｕｉｓｔ ＆ Ｈｕｅｌｓｅｎｂｅｃｋꎬ ２００３ꎻ Ｍａｈａｒａｃｈｃｈｉ￣ 金铁锁根上均能再分离到与初接菌株相同的分离
ｋｕｍｂｕｒａꎬ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１２)ꎮ 物ꎬ确定为金铁锁根腐病病原菌ꎬ因此判断病原菌
ＰＳＤ￣１、ＰＳＤ￣２、ＰＳＤ￣３ 对金铁锁的致病力较强ꎮ
２ 结果与分析 ２.４ 金铁锁根腐病病原菌的形态鉴定
ＰＳＤ￣１ 接种于 ＰＤＡ 培养基上ꎬ２８ ℃ 培养 ５ ｄ
２.１ 金铁锁根腐病症状 后ꎬ菌落呈近圆形ꎬ菌丝体较细ꎬ呈疏松绒毛状较
前期我们对金铁锁栽培基地的调研发现ꎬ金铁 贴培养基ꎬ菌落有轮转纹ꎬ内圈呈淡黄褐色ꎬ外圈
锁根腐病的叶片症状很难见到ꎬ一般根腐病发生 边缘白色ꎬ随时间的推移内圈颜色逐渐朝外圈变
后ꎬ植株叶片早已经完全枯萎脱落ꎬ导致我们采样 深ꎬ菌落背面边缘呈白色ꎬ中间呈黄褐色ꎬ菌落直
时很难在田间见到金铁锁感染根腐病后的地上部 径约为 ３.４ ｃｍꎻ小型分生孢子为卵圆形ꎬ着生于单
分症状ꎮ 实验室进行金铁锁染菌试验后ꎬ发现感染 出的分生孢子梗上ꎻ分生孢子梗细长ꎻ大型分生孢
根腐病后的金铁锁叶片会脱绿ꎬ逐渐黄化ꎬ直至枯 子较多ꎬ５ ~ ６ 分隔ꎬ多为新月型ꎻ厚垣孢子近球形ꎬ
萎、脱落、死亡ꎮ 金铁锁根部变化首先是根表皮萎 多生于菌丝的顶端或中间ꎬ壁表光滑(图 ３)ꎮ
缩ꎬ暗黄色加深直至变为黑褐色ꎬ之后软化ꎬ根部开 培养 ５ ｄ 后ꎬＰＳＤ￣２ 菌落呈不规则椭圆形ꎬ边
始从根尖慢慢向根上部开始腐烂ꎬ表面有时会长出 缘呈锯齿状ꎬ菌丝较长ꎬ绒毛状ꎬ质地棉絮状ꎬ白
白色丝状物ꎬ可能是病原菌的菌丝(图 １)ꎮ 色ꎬ菌落背面大部分呈白色ꎬ中间偶见黄色细轮
２.２ 金铁锁根腐病病原菌的分离及纯化 纹ꎬ菌落长轴为约 ３.７ ｃｍꎬ短轴为约 ２.６ ｃｍꎻ小型
对金铁锁根腐病的根系组织进行分离及纯化ꎬ 分生孢子为肾形ꎬ偶见 ２ ~ ５ 分隔ꎬ着生于分生孢子
纯化后共得到 ８５ 株真菌ꎬ８５ 株真菌的菌落在 ＰＤＡ 梗上ꎻ分生孢子梗细长ꎬ呈树枝状分生ꎻ大型分生
培养基上总共呈现三种形态(图 ２):第一种绒毛蓬 孢子 ４ ~ ７ 分隔ꎬ呈镰刀型ꎻ厚垣孢子椭圆形ꎬ壁表
松ꎬ呈轮纹状ꎬ布满整个培养基ꎬ白色(图 ２:Ａ)ꎻ第 光滑或粗糙ꎮ ＰＳＤ￣３ 菌落呈类椭圆形ꎬ边缘不整
二种呈绒毛状较贴培养基ꎬ形状不规则ꎬ白色(图 ２: 齐ꎬ菌丝浓密ꎬ质地棉絮状ꎬ白色ꎬ菌落背面颜色呈
Ｂ)ꎻ第三种有轮纹状ꎬ内圈为黄褐色绒毛ꎬ较贴培养 白色ꎬ中间有黄色小点ꎬ菌落长轴为约 ３.３ ｃｍꎬ短
基ꎬ外圈为灰白色蓬松绒毛(图 ２:Ｃ)ꎮ 轴为约 ２.８ ｃｍꎻ小型分生孢子呈肾型至卵圆形ꎬ着
２.３ 金铁锁根腐病病原菌的致病性测定 生于分生孢子梗上ꎻ分生孢子梗细长、分枝较少ꎻ
我们对分离纯化后的真菌去重复后进行了致 大型分生孢子多为 １ ~ ３ 分隔ꎬ为卵形ꎻ厚垣孢子呈
病性测定ꎬ金铁锁组培苗分别接种了病原菌 ＰＳＤ￣ 不规则球形ꎬ多生于菌丝的顶端ꎬ壁表光滑ꎮ
