Page 141 - 《广西植物》2023年第6期

６ 期 吴其妹等: 基于 ＨＰＬＣ￣ＥＣＤ 研究牡荆叶抗氧化的谱－效关系 １ １ ２ ７

１.２.２ 供试品溶液的制备 分别精密称取不同批 ５ ｍｉｎ 后 于 酶 标 仪 ５９３ ｎｍ 处 测 定 吸 光 度ꎮ 以
号的牡荆叶样品ꎬ以 ８０％ 甲 醇 为 溶 剂ꎬ按 １ ∶ ３０ Ｔｒｏｌｏｘ 溶液为标准ꎬ所有样品测量结果均以 Ｔｒｏｌｏｘ
￣１
￣１ 当量(ｍｇｇ ) 表示ꎮ Ｔｒｏｌｏｘ 标准品与吸光度值的
(ｇｍＬ )的料液比在 ２５ ℃ 下超声提取 ３０ ｍｉｎꎬ
于 ９ ０００ ｒｍｉｎ 条件下离心 ５ ｍｉｎꎬ取上清液加 回归方程为 ｙ ＝ ０.０１９ ２ｘ ＋ ０.０２２ ２ꎬ Ｒ ＝ ０.９９６ ９ꎮ
￣１
２
８０％甲醇按 １ ∶ １ 等体积稀释混匀ꎬ过 ０.２２ μｍ 有 １.２.４. ４ ＤＰＰＨ 自由 基 清 除 实 验 参 照 Ｚｈａｎｇ 等
机滤膜即制得供试品溶液ꎮ (２０１５)的方法并稍作修改ꎬ分别吸取 ８０ μＬ 的供
１.２.３ 色谱条件 ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ１８ 色谱柱 试品稀释液( 加入 ８０％ 的甲醇稀释 ２０ 倍)ꎬ加入
(３.０ ｍｍ × １５０ ｍｍꎬ ２.５ μｍ)ꎻ流动相乙腈( Ａ) － ８０％的甲醇至 ２００ μＬ 后ꎬ再加入 ＤＰＰＨ 自由基母
甲酸铵柠檬酸混合溶液( Ｂ) (２５ ｍｍｏｌＬ 甲酸铵 液[ ＤＰＰＨ ∶ ８０％ 甲 醇 ＝ １ ∶ １０ ( ｍｇ ｍＬ )] ４００
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￣１
溶液和 ２５ ｍｍｏｌＬ 柠檬酸溶液以 １ ∶ １ 等体积混 μＬꎬ摇匀ꎬ暗反应 １０ ｍｉｎ 后ꎬ于酶标仪 ５１７ ｎｍ 处测
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匀ꎬ用甲酸调 ｐＨ 至 ２.６) 梯度洗脱(０ ~ ９.５ ｍｉｎꎬ 定吸 光 度ꎮ 以 ８０％ 甲 醇 为 空 白 组ꎬ 不 同 浓 度 的
５％ → ７.５％ Ａꎻ ９.５ ~ １２.５ ｍｉｎꎬ ７.５％ → １２％ Ａꎻ Ｔｒｏｌｏｘ 溶液为对照组ꎮ 所有样品测量结果均以清
１２.５ ~ ３０ ｍｉｎꎬ保持 １２％ Ａꎻ ３０ ~ ４０ ｍｉｎꎬ １２％ →
除率表示ꎬ清除率计算公式:
１９％ Ａꎻ ４０ ~ ４８ ｍｉｎꎬ保持 １９％ Ａꎻ ４８ ~ ５３ ｍｉｎꎬ ＤＰＰＨ 清除率 ＝ (Ａ －Ａ ) / Ａ ×１００％
空白组 样品组 空白组
１９％→ ４５％ Ａꎻ ５３ ~ ５５ ｍｉｎꎬ ４５％→８０％ Ａ)ꎻＥＣＤ
(１)
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检测电 压 ７００ ｍＶꎻ 流 速 ０. ６ ｍＬ ｍｉｎ ꎻ 柱 温 ４５
１.２.４.５ ＡＢＴＳ 自 由 基 清 除 实 验 参 照 Ａａｔｉ 等
℃ ꎬ样温 １２ ℃ ꎻ进样量 １ μＬꎮ
(２０１８)的方法并稍作修改ꎬ分别吸取 １００ μＬ 的供
１.２.４ 总酚、总黄酮含量测定及体外抗氧化实验
试品稀释液( 加入 ８０％ 的甲醇稀释 ３０ 倍)ꎬ加入
１.２.４.１ 总酚含量测定 参照 Ｄｚ̇ｕｇａｎ 等( ２０１８)
２００ μＬ 的 ＡＢＴＳ 工作液ꎬ混匀暗反应 ２０ ｍｉｎ 后ꎬ于
的方法并稍作修改ꎬ先吸取 ２５０ μＬ 供试品稀释
酶标仪 ７３４ ｎｍ 处测定吸光度ꎮ 以 ８０％甲醇为空
液 ( 加 ８０％ 甲 醇 稀 释 ４０ 倍 ) 和 ２５０ μＬ ０. ２５
白组ꎬ不同浓度的 Ｔｒｏｌｏｘ 溶液为对照组ꎮ 所有样品
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ｍｏｌ Ｌ Ｆｏｌｉｎ 酚 试 剂 混 合 静 置 ３ ｍｉｎ 后ꎬ 加 入
测量结果均以清除率表示ꎬ清除率计算公式:
５００ μＬ １５％ Ｎａ ＣＯ 溶液混匀后暗反应 ３０ ｍｉｎꎬ
２ ３
ＡＢＴＳ 清除率 ＝ (Ａ 空白组 －Ａ 样品组 ) / Ａ 空白组 ×１００％
离心取上清液于酶标仪 ７６０ ｎｍ 处测定吸光度ꎮ
(２)
以没食子酸溶液为标准ꎬ所有样品测量结果均以
没食子酸当量( ｍｇｇ ) 表示ꎮ 没食子酸标准品 １.２.４.６ 氧 自 由 基 吸 收 能 力 ( ｏｘｙｇｅｎ ｒａｄｉｃａｌ
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ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｃａｐａｃｉｔｙꎬ ＯＲＡＣ) 测定 在供试品溶液
与吸光度值的回归方程为 ｙ ＝ ０.０１４ ２ｘ＋０.０６２ ５ꎬ
中加入磷酸盐缓冲溶液稀释 ５００ 倍得到供试品稀
２
Ｒ ＝ ０.９９８ ８ꎮ
释液ꎬ实验步骤参照徐维盛等(２０１４) 的方法ꎬ每隔
１.２.４.２ 总黄酮含量测定 参照 Ｈｅ 等(２０１５) 的方
５ ｍｉｎ 测定一次荧光强度ꎬ总时间为 ３ ｈꎮ 以磷酸
法并稍作修改ꎬ先吸取 ５００ μＬ 供试品稀释液( 加
盐缓冲溶液为空白组ꎬ不同浓度的 Ｔｒｏｌｏｘ 溶液为对
８０％甲醇稀释 ５ 倍)、１ ０００ μＬ ８０％ 甲醇、２５０ μＬ
照组ꎮ 所有样品测量结果均以 Ｔｒｏｌｏｘ( ｍｇｇ ) 表
￣１
５％ ＮａＮＯ 溶液ꎬ混匀放置 ６ ｍｉｎ 后ꎬ再加入 ２５０ μＬ
２
１０％ Ａｌ(ＮＯ ) 溶液ꎬ混匀放置 ６ ｍｉｎ 后ꎬ又加入 示ꎬ具体计算公式表示为式(３)和式(４):
３ ３
２ ０００ μＬ ４％ ＮａＯＨ 溶液ꎬ混匀放置 １５ ｍｉｎ 后ꎬ于 ＡＵＣ ＝ ０.５ × [ ２ × (ｆ ＋ ｆ ＋ ＋ ｆ ｎ－１ ＋ ｆ ) － ｆ －
ｎ
０
１
０
酶标仪 ５１０ ｎｍ 处测定吸光度ꎮ 以芦丁溶液为标 ｆ ] × △ｔ (３)
ｎ
准ꎬ所有样品测量结果均以芦丁当量( ｍｇｇ ) 表 式中:ＡＵＣ 为荧光衰退曲线下面积ꎻｆ 为第 ｎ
￣１
ｎ
个测定点的相对荧光强度ꎻ△ｔ 为测定荧光强度的
示ꎮ 芦丁标 准 品 与 吸 光 度 值 的 回 归 方 程 为 ｙ ＝
２
０.０００ ９ｘ ＋ ０.０４６ ０ꎬ Ｒ ＝ ０.９９９ ２ꎮ 时间间隔ꎮ
ＯＲＡＣ 值 ＝ [( ＡＵＣ －ＡＵＣ ) / ( ＡＵＣ －
１.２.４.３ 铁 离 子 还 原 能 力 ( ｆｅｒｒｉｃ ｉｏｎ ｒｅｄｕｃｉｎｇ 样品组 空白组 Ｔｒｏｌｏｘ
ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｐｏｗｅｒꎬ ＦＲＡＰ ) 测 定 参 照 王 金 梅 等 ＡＵＣ 空白组 )] × Ｃ Ｔｒｏｌｏｘ / Ｃ 样品组 ) (４)
(２０１７)的方法并稍作修改ꎬ分别吸取供试品稀释 Ｔｒｏｌｏｘ 标 准 品 与 净 荧 光 衰 退 曲 线 下 面 积
液(加入 ８０％的甲醇稀释 ６０ 倍)ꎬ加入 ８０％的甲醇 (ＡＵＣ Ｔｒｏｌｏｘ －ＡＵＣ 空白组 )的回归方程为 ｙ ＝ １.３６８ ０ｘ ＋
２
至 １００ μＬ 后ꎬ加入 ３００ μＬ ＴＰＴＺ 工作液混匀反应ꎬ ８.３０１ ９ꎬ Ｒ ＝ ０.９９４ ６ꎮ