Page 7 - 《广西植物》2023年第6期

６ 期 张镇梁等: 管叶槽舌兰新鲜及硅胶干燥根样内生菌多样性研究 ９ ９ ３

目前ꎬ关于兰科植物根部细菌结构和功能的认知还 响管叶槽舌兰正常生长的情况下ꎬ每个样品取 ３ ~
非常有限(Ｋａｕｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２１ )ꎮ 从兰科植物中分离 ５ 条长 ２ ~ ５ ｃｍ 的根段ꎬ尽量由 ３ 株以上的管叶槽
出的细菌通常属于变形菌门(Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ)、放线 舌兰根样组成ꎬ采集的同一组根样分别做新鲜及
菌门(Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ)和厚壁菌门(Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ)ꎬ不同 干燥根样的预处理ꎮ 新鲜根样预处理在根段取材
的内生细菌类群对兰科植物具有不同程度的促进 后即刻进行ꎬ步骤如下:用流水冲洗根表面后ꎬ用
作用ꎬ Ｆａｒｉａ 等 ( ２０１３) 研 究 发 现ꎬ 类 芽 孢 杆 菌 属 ５％次氯酸钠和 ７５％酒精依次消毒 ２ ｍｉｎꎬ加入无
(Ｐａｅｍｉｂａｃｉｌｌｕｓ)能促进 Ｃａｔｔｌｅｙａ ｌｏｄｄｉｇｅｓｉｉ 幼苗的生 菌水ꎬ洗净弃废液ꎬ将预处理后得到的最后一次无
长ꎮ 从兰属(Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ ｓｐ.) 根中分离出的根瘤菌 菌水进行 ＤＮＡ 提取和风险建库测试ꎬ未得到任何
属( Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ) 能 溶 解 磷 酸 钙ꎮ 此 外ꎬ Ｔａｒｋｋａ 等 结果表明样品得到了很好的预处理ꎮ 将新鲜根样
(２００８)研究表明ꎬ兰科植物菌根中存在菌根辅助细 置于－８０ ℃ 冰箱以备提取微生物组 ＤＮＡꎮ 将干燥
菌(ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ ｈｅｌｐｅｒ ｂａｃｔｅｒｉａ)ꎬ能与菌根真菌特异 根样在预处理后放入硅胶中干燥 ７２ ｈꎬ备用ꎮ 每
性结合ꎬ刺激菌根真菌的孢子萌发和菌丝生长ꎬ促 个处理重复 ８ 次ꎮ
进菌根真菌在宿主植物中定殖和生长ꎬ加强菌根 １.２ 根内微生物组 ＤＮＡ 提取、ＰＣＲ 扩增、文库构
化ꎬ从而促进植物生长及增强抗逆性( 陈耀丽等ꎬ 建及 ＨｉＳｅｑ 测序
２０１９ꎻＷａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２１)ꎮ 因此ꎬ加强兰科植物内生 使用 ＱＩＡＧＥＮ ＰｏｗｅｒＬｙｚｅｒ 试剂盒对根内微生物
细菌的研究ꎬ在兰科植物的相关微生物研究中显得 组 ＤＮＡ 进行提取ꎮ 内生真菌选择带 Ｂａｒｃｏｄｅ 的特
非常重要ꎮ 异引物(ＩＴＳ５￣１７３７Ｆ: ＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡ
管叶槽舌兰 ( Ｈｏｌｃｏｇｌｏｓｓｕｍ ｋｉｍｂａｌｌｉａｎｕｍ) 隶属 ＧＧ 和 ＩＴＳ２￣２０４３Ｒ: ＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣ )ꎬ
于兰亚科( ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｏｒｃｈｉｄｏｉｄｅａｅ) 万代兰族 ( ｔｒｉｂｅ 内 生 细 菌 选 择 带 Ｂａｒｃｏｄｅ 的 特 异 引 物 ( ｆＭ１:
Ｖａｎｄｅａｅ)槽舌兰属(Ｈｏｌｃｏｇｌｏｓｓｕｍ)ꎬ分布在中国的云 ＣＣＧＣＧＴＧＮＲＢＧＡＨＧＡＡＧＧＹＹＹＴ 和 ｒＣ５:ＴＡＡＴＣＣＴ
南以及缅甸、泰国ꎬ常附生在山地林中的树干上ꎬ海 ＧＴＴＴＧＣＴＣＣＣＣＡＣ)进行 ＰＣＲ 扩增(Ｂｅｌｌｅｍａｉｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ
拔一般在 １ ０００ ｍ 以上ꎬ具有较高的观赏价值ꎬ濒危 ２０１０ꎻＹｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３)ꎮ 反应程序:９８ ℃ 预变性 １
等级为 ＥＮ(濒危)ꎬ其野生种群亟需保护ꎮ 目前ꎬ对 ｍｉｎꎻ进入 ３０ 个扩增循环[９８ ℃ １０ ｓꎬ５０ ℃ (真菌)、
管叶槽舌兰的研究主要集中在系统发育、生物地理 ５５ ℃(细菌)３０ ｓꎬ７２ ℃ ３０ ｓ]ꎻ７２ ℃延伸 ５ ｍｉｎꎮ 反
学和细胞学等方面ꎬ对其根部内生菌的研究鲜有报 应 体 系 ( ３０ μＬ): ２ × Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ( Ｎｅｗ
道ꎮ 另外ꎬＨａｒｒｉｓｏｎ 等(２０１６) 针对植物内生微生物 Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ)１５ μＬꎬＰｒｉｍｅｒ(２ μｍｏｌＬ )３ μＬꎬ
￣１
的研究在采样时为方便野外作业经常采用硅胶干 ｇＤＮＡ １０ ｎｇꎬ补充 Ｈ Ｏ 至 ３０ μＬꎮ 使用 ２％浓度的琼
２
燥的方法ꎬ这有可能会引起根内微生物群落的极大 脂糖凝胶进行电泳检测ꎬＰＣＲ 产物胶回收纯化后使
变化ꎮ 因此ꎬ本研究采用 ＩＴＳ 和 １６Ｓ 高通量测序技 用 ＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡ ＰＣＲ￣Ｆｒｅｅ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ 建
®
术的方法ꎬ对管叶槽舌兰新鲜及硅胶干燥根样中的 库试剂盒进行文库构建ꎬ利用 Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００
内生真菌和内生细菌群落进行研究ꎬ拟探讨:(１)管 ＰＥ ２５０ 平台进行测序(北京诺禾致源生物科技有限
叶槽舌兰根样内生菌类群的多样性ꎻ(２) 管叶槽舌 公司)ꎮ

兰新鲜根样与干燥根样中内生菌群落的差异ꎻ(３) １.３ 数据分析
管叶槽舌兰根样内生细菌和真菌的比较ꎮ 本研究 测序数 据 截 去 Ｂａｒｃｏｄｅ 和 引 物 序 列 后ꎬ 使 用
为管叶槽舌兰的种植及种质资源保护提供了内生 ＦＬＡＳＨ(Ｖｅｒｓｉｏｎ １.２.７)进行拼接ꎬ得到 Ｒａｗ Ｔａｇｓ 后
真菌和细菌方面的数据ꎬ同时为研究兰科植物根内 使用 ｆａｓｔｐ 软件对 Ｒａｗ Ｔａｇｓ 进行过滤得到高质量

微生物提供采样处理的依据ꎮ 的 Ｃｌｅａｎ Ｔａｇｓꎮ 参照 Ｑｉｉｍｅ(Ｖ１.９.１)的 Ｔａｇｓ 质量控
制流 程 和 去 除 嵌 合 体 处 理 后 得 到 有 效 数 据
１ 材料与方法 Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｔａｇｓꎮ 利用 Ｕｐａｒｓｅ 软件( Ｖ ７.０.１００１) 以
９７％的一致性对所有样品的全部 Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｔａｇｓ 进
１.１ 样品采集和预处理 行聚类得到 ＯＴＵｓꎬ对出现频数最高的 ＯＴＵｓ 代表
在深圳市兰科植物保护研究中心ꎬ采集迁地 序 列 采 用 Ｑｉｉｍｅ 软 件 ( Ｖ １. ９. １ ) 中 的 Ｂｌａｓｔ 和
保护状态下的管叶槽舌兰生长健康的根ꎬ在不影 Ｍｏｔｈｕｒ 方 法 与 真 菌 数 据 库 Ｕｎｉｔｅ 和 细 菌 数 据 库