Page 88 - 《广西植物》2023年第6期

１ ０ ７ ４ 广 西 植 物 ４３ 卷

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Ａ. １００ μｍｏｌＬ 不同铝处理时间ꎻ Ｂ. 不同浓度铝处理 ４ ｈꎻ Ｃ. 不同浓度铝处理 ８ ｈꎮ 不同小写字母代表 ０.０５ 水平上存在差异ꎮ
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Ａ. １００ μｍｏｌ Ｌ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｍｅ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓꎻ Ｂ. Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ４ ｈꎻ Ｃ. Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ８ ｈ. Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｔ ｔｈｅ ０.０５ ｌｅｖｅｌ.
图 １ ＡｈＰＲＫ４ 在铝处理下的表达分析
Ｆｉｇ. １ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＡｈＰＲＫ４ ｕｎｄｅｒ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ

光调控元件ꎬ干旱胁迫响应元件和 ６０ Ｋ 蛋白结合 Ｒｏｓｅｔｔａ 菌株在 １６ ℃ 、０.５ ｍｍｏｌＬ ＩＰＴＧ 环境中
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位点(图 ４:Ａ)ꎮ 以拟南芥数据库为筛选基础ꎬ筛 培养ꎬ在约 ７１ ｋＤ 处发现诱导后的上清液中有加
选 ＡｈＰＲＫ４ 的相互作用蛋白ꎬ发现 ＡｈＰＲＫ４ 可与 深的特异性条带ꎬ表明其以可溶性的形式存在于
多个蛋白存在互作ꎬ包括 ＬＭＫ１( ｌｅｕｃｉｎｅ￣ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ 上清液中( 图 ６) ꎮ ＧＳＴ￣ＡｈＰＲＫ４￣ＣＤ 重组蛋白用
ｒｅｃｅｐｔｏｒ￣ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｌｅｃｔｉｎ￣ｌｉｋｅ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ 填 料 纯 化ꎬ 在 结 合 后 用
ｄｏｍａｉｎ １)、 ＡＢＣＢ１６ ( ＡＴＰ￣ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｂ１６)、 ＰＢＳ 洗脱 无 明 显 条 带 ( 图 ７:Ａ) ꎬ 表 明 层 析 柱 与
ＰＭＥ３０ (ｐｅｃｔｉｎ ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ ３０)、激酶 ＡＴ１Ｇ３４４２０ ＧＳＴ￣ＡｈＰＲＫ４￣ＣＤ 重 组 蛋 白 结 合 较 好ꎬ 后 经
( ｌｅｕｃｉｎｅ￣ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ 洗脱后获得了条带单一且位置正确
ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ )、 ＨＡＫ１ ( ＨＤＳ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＲＬＫ１ )、 的目的条带ꎬ表明 ＧＳＴ￣ＡｈＰＲＫ４￣ＣＤ 重组蛋白 已
ＰＥＰＲ２( ＰＥＰ１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２)、ＡＴ１Ｇ１２４６０( ｌｅｕｃｉｎｅ￣ｒｉｃｈ 成功纯化ꎮ 将获得的 ＧＳＴ￣ＡｈＰＲＫ４￣ＣＤ 纯化蛋白
ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ )、 ＡＴ１Ｇ２４６５０ 根据携带的标签蛋白经特异性 ＧＳＴ 一抗孵育ꎬ进
(ｌｅｕｃｉｎｅ￣ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ)、 行 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ 验证ꎬ可以发现在约 ７１ ｋＤ 处 出
ＦＥＩ１、ＡＴ１Ｇ４９１００ ( ｌｅｕｃｉｎｅ￣ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ 现清晰的特 异 性 目 的 条 带 ( 图 ７:Ｂ) ꎬ表 明 ＧＳＴ￣
ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ)(图 ４:Ｂ)ꎬ推测 ＡｈＰＲＫ４ 可能参与激 ＡｈＰＲＫ４￣ＣＤ 重组蛋白纯化效果较好ꎮ
素调控、细胞死亡、非生物胁迫应答、生物防御、细 ２.５ 重组蛋白体外磷酸化检测

胞壁膨大等调控过程ꎮ 将纯化的 ＧＳＴ￣ＡｈＰＲＫ４￣ＣＤ 蛋白进行体外磷
２.３ ＡｈＰＲＫ４ 激酶域克隆和原核表达载体构建 酸化实验ꎬ用磷酸化抗体检测磷酸化水平ꎬ用 ＧＳＴ

以‘ ＺＨ２’ 根尖 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ克隆到 ＡｈＰＲＫ４ 抗体标定上样水平ꎮ 由图 ８ 可知ꎬ两个磷酸化抗
胞内域 片 段 ( ＡｈＰＲＫ４￣ＣＤ) ( 图 ５: Ａ) ꎬ 序 列 长 度 体孵育后ꎬ均能在目标蛋白位置处检测到条带ꎬ磷
为１ １２２ ｂｐꎬ 与 目 的 片 段 ( ＬＯＣ１０７４７０８８４) 序 列 酸化苏氨酸抗体( ａｎｔｉ￣ｐＴ) 有着更强的磷酸化信

１００％同源ꎮ 连接 ＡｈＰＲＫ４￣ＣＤ 片段和 ｐＧＥＸ￣６ｐ￣１ 号ꎬ磷酸化酪氨酸抗体(ａｎｔｉ￣ｐＹ) 信号较弱ꎬ表明该
载体ꎬ 获 得 重 组 质 粒 ( ＡｈＰＲＫ４￣ＣＤ￣ｐＧＥＸ￣６ｐ￣１) 蛋白在原核诱导的过程中已经发生了磷酸化修
( 图 ５:Ｂ) ꎮ 饰ꎮ 但与对照组相比ꎬＡＴＰ 处理并未使得条带有
２.４ 重组蛋白诱导表达和纯化 加深的现象(图 ８)ꎬ暗示 ＡｈＰＲＫ４￣ＣＤ 蛋白不存在
将 含 有 ＡｈＰＲＫ４￣ＣＤ￣ｐＧＥＸ￣６ｐ￣１ 重 组 质 粒 的 体外自磷酸化活性ꎮ