Page 195 - 《广西植物》2024年第5期

５ 期 赵淑丽等: 根肿菌侵染下菘蓝生物碱合成机制 ９ ８ ３

固定 ２４ ｈꎻ再将组织从 ＦＡＡ 固定液中取出并切成
１ 材料与方法 薄片ꎻ于台盼蓝染液中染色 ２ ｍｉｎꎬ染色后用去离
子水(ｄｄＨ Ｏ)洗去残留的染液ꎬ清洗 ２ ~ ３ 次ꎻ染上
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１.１ 材料 色的根组织薄片放在载玻片上进行显微观察ꎮ
供试菌株和菘蓝品种:菌株采自昆明市盘龙 １.３.２ 生理指标的测定 小叶菘蓝叶片生理指标
区阿子营乡的大白菜发病根瘤ꎬ经云南省农业科 的测定主要参照高俊凤(２００６) 和王文龙(２０１４)

学院鉴定为 ４ 号生理小种( Ｗｉｌｌｉａｍｓ 鉴定系统)ꎮ 的方法ꎬ具体如下:(１) 硫代巴比妥酸显色法检测
实验所需小叶菘蓝种子由云南省农业科学院园艺 ＭＤＡꎻ(２)考马斯亮蓝 Ｇ￣２５０ 染色法检测可溶性蛋
作物研究所的十字花科课题组张丽琴老师提供并 白ꎻ(３) 愈创木酚比色法检测 ＰＯＤꎻ(４) 氮蓝四唑

鉴定ꎮ 光还原 法 检 测 ＳＯＤꎻ ( ５) 邻 苯 二 酚 法 检 测 ＰＰＯꎻ
试剂及仪器:台盼蓝溶液( ＳＩＧＭＡ)、甲醛－醋 (６)紫外分光光度法检测 ＣＡＴꎮ
酸－乙醇固定液(５０％)ꎻ牛血清蛋白、核黄素、愈创 １.３.３ ＵＰＬＣ￣ＭＳ / ＭＳ 测定
木酚、２－硫代巴比妥酸ꎬ北京索莱宝科技有限公 １.３.３.１ 样品制备 将小叶菘蓝的根及根茎放置于
司ꎻ邻苯二酚、三氯乙酸溶液、Ｌ￣甲硫氨酸ꎬ上海麦 冻干机( Ｓｃｉｅｎｔｚ￣１００Ｆ) 中真空冷冻干燥后研磨ꎻ称
克林 生 化 科 技 有 限 公 司ꎻ 氯 化 硝 基 四 氮 唑 蓝 取 ５０ ｍｇ 的粉末ꎬ加入 ７０％ 甲醇(１.２ ｍＬ)ꎬ３０ ｍｉｎ
(ＮＢＴ)、乙二胺四乙酸 ＥＤＴＡꎬ德国 Ｂｉｏｆｒｏｘｘ 生物试 涡旋 １ 次(每次 ３０ ｓꎬ共 ６ 次)ꎻ１２ ０００ ｒｍｉｎ ꎬ离
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剂ꎻ过 氧 化 氢 ( ３０％)ꎬ 云 南 景 锐 科 技 有 限 公 司ꎮ 心 ３ ｍｉｎ 后ꎬ０.２２ μｍ 微孔滤膜将上清液过滤在进
Ｎｉｋｏｎ 数码显微镜ꎬ血球计数板ꎬ育苗盘ꎬ普析 ＴＵ￣ 样瓶中ꎬ用于后续实验ꎮ
１８１０ 紫外可见分光光度计ꎬ超低温冷冻离心机ꎬ光 １.３.３.２ 色谱质谱条件 ＥｘｉｏｎＬＣ ＴＭ ＡＤ 超高效液相
照培养箱ꎬ台式鼓风干燥箱ꎬ电热恒温水浴锅ꎬ千 色谱 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｃｉｅｘ. ｃｏｍ. ｃｎ / )ꎬ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
分之一电子天平ꎬ托盘天平ꎬ冷冻冰箱等ꎮ ４５００ ＱＴＲＡＰ 串 联 质 谱 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｃｉｅｘ. ｃｏｍ. ｃｎ / )ꎮ
１.２ 实验处理 液相色谱条件:色谱柱为 ＳＢ￣Ｃ (１.８ μｍꎬ２.１ ｍｍ ×
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将冷冻的大白菜发病根瘤置于室温解冻ꎬ采 １００ ｍｍꎬＡｇｉｌｅｎｔ)ꎻ０.１％甲酸的超纯水(Ａ) 与 ０.１％
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用杨佩文等(２００２) 的方法提取根肿菌休眠孢子ꎬ 甲酸乙腈( Ｂ) 为流动相ꎬ流速为 ０.３５ ｍＬｍｉｎ ꎻ
血球计数板测定根肿菌孢子悬浮液的浓度ꎬ稀释 洗脱梯度(Ｂ 相比例)为 ０.００ ｍｉｎꎬ５％ꎬ９.００ ｍｉｎ 内
成 ５×１０ ＣＦＵｍＬ 的病原菌菌液备用ꎮ 小叶菘 线性增加 至 ９５％ꎬ并 维 持 在 ９５％ １ ｍｉｎꎬ１０. ００ ~
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蓝于 ７２ 孔育苗盘中栽培ꎬ１ 个穴播种 ３ 颗种子ꎬ待 １１.１０ ｍｉｎꎬ９５％ ~ ５％ꎬ１１.１０ ~ １４.００ ｍｉｎꎬ５％ꎻ进样
其长出 ２ ~ ３ 对真叶后间苗ꎬ注射法 进 行 根 肿 菌 量 ４ μＬꎻ柱温为 ４０ ℃ ꎮ 质谱条件:电喷雾离子源ꎻ
(１×１０ ＣＦＵｍＬ 的休眠孢子)接种ꎬ用 １０ ｍＬ 注 电压为＋５ ５００ / －４ ５００ Ｖꎻ温度为 ５５０ ℃ ꎻ离子源
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射器吸取菌液ꎬ将菌液缓慢注射到实验苗根部ꎬ每 气体 Ｉ、气体Ⅱ及气帘气分别设置为 ５０、６０、２５ ｐｓｉꎻ
株 ２ ｍＬ 菌液ꎮ 分别在接种根肿菌后 ０、７、１４、２１ ｄ 碰撞诱导电离参数设置为高ꎮ
采 集 正 常 生 长 ( ＢＬＧ￣ＣＫ１、 ＢＬＧ￣ＣＫ２、 ＢＬＧ￣ＣＫ３、 ＯＰＬＳ￣ＤＡ 模型 中 的 ＶＩＰ 值 结 合 差 异 倍 数 值
ＢＬＧ￣ＣＫ４) 和接种根肿菌( ＢＬＧ￣Ｓ１、ＢＬＧ￣Ｓ２、ＢＬＧ￣ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ 来筛选差异代谢物ꎮ 筛选标准:符合
Ｓ３、ＢＬＧ￣Ｓ４)的小叶菘蓝根部( 根及根茎) 和叶子 ＶＩＰ ≥ １、ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ≥ １.５ 和 ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ≤ ０.６７

(Ｌａｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９)ꎬ３ 个生物学重复ꎬ并液氮冷冻ꎬ 的代谢物具有显著差异ꎮ
－８０ ℃ 储存ꎮ １.３.４ ＲＮＡ 提取和文库构建 ＲＮＡ 提取与测序由
１.３ 方法 武汉 迈 维 代 谢 有 限 公 司 完 成ꎮ 采 用 Ｉｌｌｕｍｉｎａ 的
１.３.１ 病情形态分级和组织学观察 病情分级参 ＮＥＢＮｅｘｔ ＵｌｔｒａＴＭ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ 试剂盒提
®
照农业部公益性行业科研专项(２０１００３０２９) 制定 取 ｔｏｔａｌ ＲＮＡꎮ 琼脂糖凝胶电泳和 Ｎａｎｏ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ
的标准( 杨华等ꎬ２０１４)ꎮ 接种根肿菌后根据病情 分光光度计检测 ＲＮＡ 完整性和纯度ꎮ 最终达标
形态分级每 ２４ ｈ 观察根肿情况并取小叶菘蓝根部 的样品用于构建小叶菘蓝 ｃＤＮＡ 文库ꎮ
进行组织学观察ꎬ连续观察 ２１ ｄꎮ 将小叶菘蓝根 １.３.５ 转录组测序、分析及注释 利用 Ｉｌｌｕｍｉｎａ 对
部洗干净ꎬ取地下 １ ~ ２ ｃｍ 于 ＦＡＡ 固定液中至少 小叶菘蓝根及根茎转录组文库进行高通量测序ꎮ