Page 196 - 《广西植物》2024年第5期
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９ ８ ４ 广 西 植 物 ４４ 卷
通过 ＣＡＳＡＶＡ 碱基识别将原始的图像数据转化为 胞层次展示了根肿菌侵染植株的整个发病过程ꎬ
原始数据( ｒａｗ ｄａｔａ)ꎬ经数据评估、过滤除杂及冗 同时也说明了根肿菌人工接种的可行性ꎮ
余处 理 等 质 控 获 得 高 质 量 序 列 ( ｃｌｅａｎ ｒｅａｄｓ)ꎬ ２.２ 生理生化指标测定
Ｔｒｉｎｉｔｙ 组 装 并 层 次 聚 类 后 得 Ｕｎｉｇｅｎｅꎮ 使 用 由图 ３ 可知ꎬ接菌处理的可溶性蛋白、ＭＤＡ 含
ＤＩＡＭＯＮＤ ＢＬＡＳＴＸ 与 ＨＭＭＥＲ 软件将 Ｕｎｉｇｅｎｅ 序 量和防御酶 ＳＯＤ、ＰＯＤ、ＰＰＯ、ＣＡＴ 的活性随接菌时
列 与 Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ ( ＧＯ )、 ＴｒＥＭＢＬ、 Ｋｙｏｔｏ 间的延长呈不断上升的趋势ꎻ接菌后 ７ ~ ２１ ｄꎬ实验
Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ(ＫＥＧＧ)、Ｓｗｉｓｓ￣ 组的 ＣＡＴ、ＳＯＤ 活性均显著高于相应对照组( Ｐ<
Ｐｒｏｔ、ｅｕＫａｒｙｏｔｉｃ Ｏｒｔｈｏｌｏｇ Ｇｒｏｕｐｓ(ＫＯＧ)、ＮＲ、Ｐｒｏｔｅｉｎ ０.０５)ꎻ接菌后 １４ ~ ２１ ｄꎬ实验组的可溶性蛋白、
ｆａｍｉｌｙ( Ｐｆａｍ) 数据库进行比对ꎬ得到基因功能信 ＭＤＡ 含量以及 ＰＯＤ、ＰＰＯ 活性均显著高于对照组
息ꎮ 用 ＤＥＧＳｅｑ Ｒ 包 鉴 定 差 异 表 达 基 因 (Ｐ<０.０５)ꎮ 这说明菘蓝为抵抗根肿菌侵染自身做
(ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓꎬＤＥＧｓ)ꎬ规定同时符 出了防御反应ꎮ
合错 误 发 现 率 ( ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅꎬＦＤＲ) < ０. ０５ꎬ ２.３ 代谢组分析
｜ ｌｏｇ 差异倍数( ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅꎬＦＣ) ｜ ≥１ 的基因确定 ２.３.１ 样品检测及 ＯＰＬＳ￣ＤＡ 分析 本实验对 ７ 组样
２
为差异表达的基因并对其进行功能富集分析ꎮ 本[ ＢＬＧ￣ＣＫ１( Ｓ１)、ＢＬＧ￣ＣＫ２、ＢＬＧ￣ＣＫ３、ＢＬＧ￣ＣＫ４、
１.３.６ ｑＲＴ￣ＰＣＲ 分析 植物 ＲＮＡ 提取同 １.３.４ 节ꎮ ＢＬＧ￣Ｓ２、ＢＬＧ￣Ｓ３、ＢＬＧ￣Ｓ４] 进行代谢研究ꎮ 基于检
根据转录组数据结果中的 ＦＰＫＭ 值筛选 １３ 个差 测平台和自建数据库共检测到 １６１ 种生物碱ꎬ其他
异基因ꎬ采用 Ｍｏｎａｄ 试剂盒合成 ｃＤＮＡꎬ以 ｃＤＮＡ 类生物碱数量最多ꎬ占总生物碱的 ５３％ꎬ其次是吲
为模板、菘蓝 Ａｃｔｉｎ 基因(Ｑｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９)为内参进 哚类生物碱占总生物碱的 ３２％( 图 ４)ꎮ 由图 ５ 可
行 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 实验ꎮ 利用 Ｐｒｉｍｅｒ￣ＢＬＡＳＴ 设计引物 知ꎬ正 交 偏 最 小 二 乘 判 别 分 析 ( ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｐａｒｔｉａｌ
(表 １)以及 ＡＢＩ ７５００ 荧光定量 ＰＣＲ 仪进行 ｑＲＴ￣ ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ￣ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓꎬＯＰＬＳ￣ＤＡ) 结果显
ＰＣＲ 分析ꎮ 扩增程序:９５ ℃ ꎬ２ ｍｉｎ 预变性ꎻ９５ ℃ ꎬ 示各组样品均能得到明显分离ꎬ并且 ＢＬＧ￣ＣＫ３ 和
５ ｓ 变性ꎻ６０ ℃ ꎬ３０ ｓ 退火 / 延伸(４０ 个循环)ꎻ熔解 ＢＬＧ￣Ｓ３ 的分离距离最大ꎬ ＢＬＧ￣ＣＫ４ 和 ＢＬＧ￣Ｓ４ 次
曲线为从 ６５ ℃ 升至 ９５ ℃ ꎬ每升温 ０.５ ℃ 采集 １ 之ꎬ说明接菌 １４ ｄ 时根肿菌对菘蓝代谢影响最大ꎮ
次荧 光 信 号ꎮ 每 个 样 品 均 设 置 ３ 个 重 复ꎬ 使 用 ２.３.２ 差异代谢物筛选 进一步对接菌后 ７、１４、２１
－ΔΔＣｔ
２ 法进行实时荧光定量 ＰＣＲ 结果的计算ꎮ 将 ｄ 的菘蓝差异代谢物进行分析ꎬ发现 ＢＬＧ￣ＣＫ２ ｖｓ
实验 结 果 数 据 表 示 为 平 均 值 ± 标 准 差ꎬ 并 采 用 ＢＬＧ￣Ｓ２ 有 １６ 种差异代谢物ꎬ６ 个上调ꎬ１０ 个下调ꎻ
Ｇｒａｐｈｐａｄ 软件对各组数据进行 Ｔ 检验ꎬ以 Ｐ<０.０５ ＢＬＧ￣ＣＫ３ ｖｓ ＢＬＧ￣Ｓ３ 有 １７ 种差异代谢物ꎬ９ 个上
表示差异有统计学意义ꎮ 调ꎬ８ 个下调ꎻＢＬＧ￣ＣＫ４ ｖｓ ＢＬＧ￣Ｓ４ 有 ３９ 种差异代
谢物ꎬ３２ 个上调ꎬ７ 个下调ꎻＢＬＧ￣Ｓ２ ｖｓ ＢＬＧ￣Ｓ３ 有
２ 结果与分析 １９ 个差异代谢物ꎬ３ 个上调ꎬ１６ 个下调ꎻＢＧ￣Ｓ２ ｖｓ
ＢＬＧ￣Ｓ４ 有 ４５ 个差异代谢物ꎬ１９ 个上调ꎬ２６ 个下
２.１ 病情形态分级和组织学观察 调ꎻＢＧ￣Ｓ３ ｖｓ ＢＬＧ￣Ｓ４ 有 ３４ 个差异代谢物ꎬ１４ 个上
由图 １ 和图 ２ 可知ꎬ接菌后 ０ ｄ 根部发育正常 调ꎬ２０ 个下调(表 ２)ꎮ 由图 ６ 可知ꎬ将 ＢＬＧ￣ＣＫ２ ｖｓ
无肿瘤ꎬ病情指数为 ０ 级且组织学观察发现细胞 ＢＬＧ￣Ｓ２、ＢＬＧ￣ＣＫ３ ｖｓ ＢＬＧ￣Ｓ３、ＢＬＧ￣ＣＫ４ ｖｓ ＢＬＧ￣Ｓ４
排列整齐(图 １:Ｅꎻ图 ２:Ａ)ꎻ接菌后 ７ ｄ 根部开始 这 ３ 组差异代谢物取交集后发现共有 ５ 个差异代
出现肿大症状ꎬ病情指数为 １ 级ꎬ组织学观察发现 谢物ꎬ分别为环芸薹宁、ｉｓａｔｉｎｄｏｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ Ｂ、５ꎬ６￣
皮层细胞明显增大ꎬ挤压变形(图 １:Ｆꎻ图 ２:Ｃ)ꎻ接 二羟基吲哚￣５￣Ｏ￣β￣葡萄糖苷、泛酰巯基乙胺和对
菌后 １４ ｄ 主根肿块直径小于茎基部直径的 ２ 倍ꎬ 香豆酰亚精胺ꎬ其中前 ３ 种为吲哚类生物碱ꎮ 将
病情指数为 ３ 级ꎬ同时次级游动孢子遍布皮层细 ＢＬＧ￣Ｓ２ ｖｓ ＢＬＧ￣Ｓ３、ＢＬＧ￣Ｓ２ ｖｓ ＢＬＧ￣Ｓ４、ＢＬＧ￣Ｓ３ ｖｓ
胞并开始入侵维管柱(图 １:Ｇꎻ图 ２:Ｅ)ꎻ接菌后 ２１ ＢＬＧ￣Ｓ４ 这 ３ 组差异代谢物取交集后发现共有 ２ 个
ｄ 根部出现较大肿瘤ꎬ其直径是茎基部直径的 ２ ~ ３ 差 异 代 谢 物ꎬ 分 别 是 吲 哚 类 生 物 碱
倍ꎬ判定病情指数为 ５ 级ꎬ同时次级游动孢子遍布 ｉｓａｔｉｓｉｎｄｉｇｏｔｉｃａｎｉｎｅ Ｂ 和喹啉类生物碱 ２￣氧￣３ꎬ４￣二
皮层和维管柱( 图 １:Ｈꎻ图 ２:Ｆ)ꎮ 这从表观到细 氢￣１Ｈ￣喹啉￣３￣羧酸ꎮ
