Page 129 - 《广西植物》2020年第8期
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１ １ ８ ４ 广 西 植 物 ４０ 卷
图 １ ＣｒＪＡＲ１ 蛋白的氨基酸序列
Ｆｉｇ. １ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＣｒＪＡＲ１ ｐｒｏｔｅｉｎ
的一些基本理化性质ꎬ推测 ＣｒＪＡＲ１ 蛋白的分子量 ＣｒＪＡＲ１ 质粒和 ｐＥＴ￣３０ｂ 载体进行双酶切ꎬ分别回
为 ６５. ９５ ｋＤꎬ 等 电 点 ｐＩ 为 ５. ７３ꎬ 分 子 式 为 收载体片段和 ＣｒＪＡＲ１ 片段ꎬ通过 Ｔ ＤＮＡ 连接酶
４
Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ Ｓ ꎬ带正电荷的残基( Ａｒｇ＋Ｌｙｓ) 总 进行连接ꎬ构建 ｐＥＴ￣３０ｂ￣ＣｒＪＡＲ１ 原核表达载体ꎬ并
２９５９ ４６１４ ７７２ ８８０ ２７
数为 ６５ꎬ带负电荷的残基(Ａｓｐ＋Ｇｌｕ) 总数为 ７５ꎬ脂 转化到大肠杆菌 ＸＬ￣１０Ｇｏｌｄ 超级感受态细胞中ꎮ
肪指数为 ８３.９７ꎬ亲水性为－ ０.２５４ꎬ不稳定指数为 挑取单克隆菌落ꎬ经过 ＰＣＲ 验证后ꎬ在 １ ７００ ｂｐ 左
４０.０２ꎬ这将 ＣｒＪＡＲ１ 蛋白归类为不稳定蛋白ꎮ 通 右存在明显条带ꎮ 提取质粒后ꎬ用 Ｋｐｎ Ｉ 和 Ｓａｃ Ｉ
过使用 ＩｎｔｅｒＰｒｏ Ｓｃａｎ 分析 ＣｒＪＡＲ１ 蛋白ꎬ其结果显 进行双酶切ꎬ其结果如图 ４ 所示ꎬ结果正确ꎮ 将该
示 ＣｒＪＡＲ１ 蛋白含有保守结构域ꎬ位于第 １９ ~ ５６０ 菌液送至北京华大基因进行测序ꎬ测序结果与前
氨基酸处(茉莉酸酰胺合成酶ꎬＩＰＲ０３１１１０)ꎬ并且 期克 隆 ＣｒＪＡＲ１ 基 因 的 结 果 一 致ꎬ 证 明 ｐＥＴ￣３０ｂ￣
ＣｒＪＡＲ１ 蛋白属于 ＧＨ３ 家族ꎮ ＣｒＪＡＲ１ 原核表达载体构建成功ꎮ
ＪＡＲ１ 系统进化树分析结果如图 ２ 所示ꎮ 从图 ２.３ 重组蛋白的原核表达与 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 分析
２ 可以看出ꎬ长春花与笋瓜和番木瓜的 ＪＡＲ１ 蛋白 将 ｐＥＴ￣３０ｂ￣ＣｒＪＡＲ１ 转入 ＢＬ２１ 表达宿主中ꎬ复
的亲缘关系比较近ꎮ ＳｉｇｎａｌＰ ４.１ ｓｅｒｖｅｒ 预测结果 苏后扩大培养至 ２００ ｍＬ ＬＢ 培养基中ꎬ待 ＯＤ 为
６００
表明 ＣｒＪＡＲ１ 蛋白不含有信号肽ꎬ且不存在跨膜区 ０.６ 左右时ꎬ取出 ２ ｍＬ 菌液作为 ０ ｈ 样品ꎬ然后分
域ꎮ 通 过 使 用 ＴａｒｇｅｔＰ １. １ Ｓｅｒｖｅｒ 分 析 长 春 花 别加入终浓度 ０.４、１ ｍｍｏｌＬ ＩＰＴＧ 在 １６、３７ ℃
￣１
ＣｒＪＡＲ１ 蛋白的亚细胞定位ꎬ其中叶绿体的定位系 诱导条件诱导表达ꎬ并且在 ２、４、８、１６ ｈ 四个时间
数为 ０.１２４ꎬ线粒体的定位系数为 ０.０８６ꎬ其他位置 点分别收集菌液ꎮ 通过 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 分析蛋白表达
为 ０.９１２ꎬ因此该蛋白可能位于细胞质中ꎮ 进一步 情况ꎮ 如图 ５ 所示ꎬ在 ７０ 和 ５０ ｋＤ 之间有明显条
利用 ＳＯＰＭＡ 预测ꎬ发现 α￣螺旋占 ４１.８８％ꎬ不规则 带ꎬ与 ＣｒＪＡＲ１ 蛋白的分子量 ６５.９５ ｋＤ 相近ꎬ并且
卷曲占 ３８.８％ꎬ表明它们构成了蛋白的主要结构ꎬ 在 １６、３７ ℃ 两种温度诱导条件下ꎬ随着诱导时间
其次还包括部分延伸链(１４.３６％) 和少部分 β￣转 的增加ꎬ条带明显加深ꎬ表明随着诱导时间的增
角(４.９６％)分散在蛋白质中ꎮ ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ 预测 加ꎬＣｒＪＡＲ１ 蛋白的表达量越来越多ꎮ 上述研究为
ＣｒＪＡＲ１ 蛋白的三级结构ꎬ如图 ３ 所示ꎬ以 ＣｒＪＡＲ１ 后续纯化以及体外研究提供一定依据ꎮ
蛋白的同源模型 ５ｅｃｈ.２.Ａꎬ在第 １０ ~ ５８４ 位氨基酸
建模ꎬ其模型覆盖率为 ６４.５１％ꎮ ３ 讨论与结论
２.２ 原核表达载体重组质粒的构建
通过 Ｋｐｎ Ｉ 和 Ｓａｃ Ｉ 对 测 序 正 确 的 ｐＧＭ￣Ｔ￣ 茉莉酸－异亮氨酸合成酶 (ＪＡＲ１)的功能在许
