Page 128 - 《广西植物》2020年第8期
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８ 期 林颖等: 长春花茉莉酸－异亮氨酸合成酶 ＣｒＪＡＲ１ 生物信息学分析与原核表达 １ １ ８ ３
ＣｒＪＡＲ１ꎬ并且在长春花叶片中过表达了 ＣｒＪＡＲ１ꎬ发 ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ｉｎ￣
现显著提高了合成长春质碱和文多灵途径中相关 ｔｅｒａｃｔｉｖｅ / ＲＲ９Ｂｅｚ/ ｍｏｄｅｌｓ/ )预测三级结构ꎮ
关键酶基因的表达量ꎬ并且促进了文多灵和长春 １.３ ｐＥＴ￣３０ｂ￣ＣｒＪＡＲ１ 重组质粒的构建
质碱的积累ꎮ 为了进一步研究长春花中 ＣｒＪＡＲ１ 利用 限 制 性 核 酸 内 切 酶 Ｋｐｎ Ｉ 和 Ｓａｃ Ｉ 对
蛋白在茉莉酸信号通路中的功能以及对下游 ＴＩＡｓ ｐＧＭ￣Ｔ￣ ＣｒＪＡＲ１ 质粒和 ｐＥＴ￣３０ｂ 载体进行双酶切ꎬ
的生物合成的影响ꎬ本研究将 ＣｒＪＡＲ１ 进行原核细 ３７ ℃ 恒温培养 ３ ｈꎬ使用 １％的琼脂糖凝胶电泳进
胞表达ꎬ初步确定了表达条件ꎬ并对该蛋白的氨基 行分离ꎮ 将酶切后的 ＣｒＪＡＲ１ 基因片段和 ｐＥＴ￣３０ｂ
酸序列以及其结构进行了分析ꎮ 这为体外研究 载体进行胶回收ꎬ通过 Ｔ ＤＮＡ 连接酶连接ꎬ连接
４
ＪＡＲ１ 功能、深入研究茉莉酸信号通路调控次级代 体系: １０ × Ｔ ＤＮＡ Ｌｉｇａｎｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ １ μＬꎬ 回 收 的
４
谢产物的生成具有重要意义ꎮ ｐＥＴ￣３０ｂ 载 体 ３ μＬꎬ 酶 切 后 的 ＣｒＪＡＲ１ ５ μＬꎬ Ｔ
４
ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ １ μＬꎮ 在 ４ ℃ 连接 ２４ ｈꎮ 将连接产物
１ 材料与方法 ｐＥＴ￣３０ｂ￣ＣｒＪＡＲ１ 转化到大肠杆菌 ＸＬ￣１０Ｇｏｌｄ 超级
感受态细胞中ꎮ 将连接产物 ｐＥＴ￣３０ｂ￣ＣｒＪＡＲ１ 加入
１.１ 材料和试剂 到大肠杆菌 ＸＬ￣１０Ｇｏｌｄ 超级感受态细胞中ꎬ冰上放
采取野生型长春花叶片为材料ꎮ ｐＥＴ￣３０ｂ 载 置 ５ ｍｉｎꎬ４２ ℃ 水浴 ３０ ｓꎬ冰上放置 １０ ｍｉｎꎬ加入
￣１
体和大肠杆菌 ＢＬ２１(ＤＥ３)感受态细胞均为本实验 ７００ μＬ 新鲜 ＬＢ 培养基ꎬ１８０ ｒｍｉｎ ３７ ℃ 震荡 １
￣１
室保藏ꎮ ＴＲＮｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ 试剂、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｉ、 ｈ 后ꎬ４ ０００ ｒｍｉｎ 离心 ３ ｍｉｎꎬ涂布于平板上ꎮ 挑
ＴＩＡＮ Ｓｃｒｉｐｔ Ｍ￣ＭＬＶ 反转录酶、ｐＧＭ￣Ｔ 载体、普通 取单菌落ꎬ并利用 ＣｒＪＡＲ１ 引物进行菌落 ＰＣＲ 验
琼脂糖凝胶 ＤＮＡ 回收试剂盒购自天根生化科技 证ꎬ确 定 阳 性 克 隆ꎬ 并 将 正 确 的 样 品 进 行 测 序
有限公司ꎻＰｒｉｍｅ ＳＴＡＲ 酶、ＥｘＴａｑ 酶、限制性核酸 验证ꎮ
内切酶(Ｋｐｎ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ)、Ｔ ＤＮＡ 连接酶购自 Ｔａｋａｒａ １.４ 蛋白的诱导表达与 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 检测
４
公司ꎻ琼脂糖凝胶购自美国 Ｐｒｏｍｅｇａ 公司ꎻ其他试 将测序正确的阳性克隆接入 ５０ ｍＬ ＬＢ 培养基
剂如乙醇、氯仿、异丙醇等均购自北京化工厂ꎮ 中ꎬ３７ ℃ 复苏ꎬ并以 ２％的接入量接入 ２００ ｍＬ ＬＢ
１.２ 长春花 ＣｒＪＡＲ１ 蛋白的氨基酸序列分析 培养基中ꎬ３７ ℃ 震荡培养至 ＯＤ 为 ０.６ 左右时ꎬ
６００
长春花 ＣｒＪＡＲ１ 基因的克隆在本实验室的前 加入 ＩＰＴＧꎬ终浓度分别为 ０.４、１ ｍｍｏｌＬ ꎬ分别在
￣１
期已经完成( 徐岩等ꎬ２０１７)ꎮ 通 过 ＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏ￣ １６、３７ ℃ 下诱导培养ꎬ分别收集不同时间的表达产
ｔｅｍｉｃｓ Ｓｅｒｖｅｒ 提供的在线软件 ＰｒｏｔＰａｒａｍ( ｈｔｔｐｓ: / / 物(０、２、４、８、１６ ｈ)ꎮ 分别配制分离胶和浓缩胶ꎬ
ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ / )分析 ＣｒＪＡＲ１ 蛋 首先配制浓度为 １０％ 的分离胶ꎬ再 配 制 浓 度 为
白的氨基酸组成ꎬ并且预测 ＣｒＪＡＲ１ 基因编码的蛋 ５％的浓缩胶ꎬ进行电泳时ꎬ在浓缩胶部分ꎬ首先保
白质 的 理 化 性 质ꎬ 通 过 ＩｎｔｅｒＰｒｏ Ｓｃａｎ ( ｈｔｔｐ: / / 持电压为 ８０ Ｖꎬ当到达分离胶以后ꎬ调整电压ꎬ使
ｗｗｗ.ｅｂｉ.ａｃ.ｕｋ / ｉｎｔｅｒｐｒｏ / ) 来分析蛋白质的保守区 电压保持在 １２０ Ｖꎬ当样品至分离胶底部时ꎬ关闭
域ꎮ 分 别 使 用 ＴａｒｇｅｔＰ １. １ Ｓｅｒｖｅｒ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. 电源ꎬ将分离胶取出ꎬ用考马斯亮蓝进行染色ꎬ脱
ｃｂｓ. ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＴａｒｇｅｔＰ / ) 和 ＳｉｇｎａｌＰ ４.１ ｓｅｒｖｅｒ 色后检验ꎮ
( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｃｂｓ. ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＳｉｇｎａｌＰ / ) 及
２ 结果与分析
ＴＭＨＭＭ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｃｂｓ. ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＴＭ￣
ＨＭＭ / ) 分析长春花 ＣｒＪＡＲ１ 蛋白的亚细胞定位、
是否含有信号肽以及跨膜区域ꎬ通过 ＭＥＧＡ ５.１ 软 ２.１ 长春花 ＣｒＪＡＲ１ 氨基酸序列分析
件的 ＵＰＧＭＡ 法构建系统进化树ꎬ使用在线软件 长春 花 ＣｒＪＡＲ１ 基 因 编 码 ５８５ 个 氨 基 酸 ( 图
ＳＯＰＭＡ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｎｐｓａ￣ｐｒａｂｉ. ｉｂｃｐ. ｆｒ/ ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｓｅｃｐｒｅｄ＿ １)ꎬ通过 ＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏｔｅｍｉｃｓ Ｓｅｒｖｅｒ 提供的在线软件
ｓｏｐｍａ.ｐｌ) 预 测 ＣｒＪＡＲ１ 蛋 白 的 二 级 结 构ꎬ 使 用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ 预测分析 ＣｒＪＡＲ１ 基因所编码的蛋白质
