Page 109 - 《广西植物》2023年第10期
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１０ 期 王玉凤等: 欧耧斗菜 ＡＰ２ / ＥＲＦ 基因家族鉴定及盐胁迫下表达分析 １ ８ ６ ３
间根与叶中 ＡＰ２ / ＥＲＦ 基因表达模式进行分析、系 准化ꎻ利用 ＤＥＧｓｅｑ 软件进行处理组和对照组的比
统进化分析并进行分类及功能预测ꎮ 本研究以期 较ꎬ差异表达显著的标准为 ｜ ｌｏｇ ( Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ) ｜ >
２
为下一步研究欧耧斗菜 ＡＰ２ / ＥＲＦ 基因在抗盐过 １、Ｐ(ｐａｄｊ) <０.０５ꎬ符合以上标准的基因视为差异
程中的生物学功能提供参考ꎮ 基因( 牛 苏 燕 等ꎬ２０２３)ꎮ 利 用 ＴＢｔｏｏｌｓ 绘 制 热 图
谱ꎬＲｏｗ Ｓｃａｌｅ 标准化ꎬＣｌｕｓｔｅｒ Ｒｏｗｓ 聚类ꎬ其他参数
１ 材料与方法 默认ꎬ并进行表达模式分析ꎮ
１.４ 实时荧光定量 ＰＣＲ
１.１ 转录组测序试验材料 为了验证转录组测序的结果及目标基因的表
欧耧斗菜盐胁迫下转录组数据为课题组前期 达模式ꎬ设计特异引物(表 １)ꎬＩＰＰ２ 作为内参基因
试验获得ꎬ种子为吉林农业大学观赏植物资源团 (Ｓｈａｒｍａ ＆ Ｋｒａｍｅｒꎬ ２０１３)ꎬ经实时荧光定量 ＰＣＲ
队保存ꎮ 于 ２０２０ 年 ６ 月播种ꎬ待幼苗长至 ６ 片真 检测欧耧斗菜部分 ＡＰ２ / ＥＲＦ 基因在盐胁迫下不
叶时ꎬ选择长势良好、株高冠幅相近的植株ꎬ进行 同时间在根和叶中的表达ꎮ 用 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ检
￣１
２００ ｍｍｏｌＬ ＮａＣｌ 溶液处理ꎬ在 ０( ＣＫ)、１２、２４、 测特异引物的 ＰＣＲ 产物ꎬ反应体系:２ ×ＳＹＢＲ Ｍｉｘ
４８ ｈ 后分别对根和叶片进行取样ꎬ重复 ３ 次ꎬ盐溶 主混合物 １０ μＬ、上下游引物 １ μＬ、模板( ｃＤＮＡ)２
液浓度及处理时间均由预试验确定ꎮ 样品在液氮 μＬ、ｄｄＨ Ｏ ６ μＬꎮ ＰＣＲ 反应程序:预变性(９５ ℃ ꎬ１
２
中迅速冷冻后置于－ ８０ ℃ 冰箱中保存备用ꎬ由北 ｍｉｎ)ꎬ放大定量(９５℃ ꎬ２０ ｓꎻ６０℃ ꎬ２０ ｓꎻ７２℃ ꎬ３０ ｓꎬ
京诺禾致源科技股份有限公司进行转录组测序并 重复 ４０ 次)ꎬ熔解曲线(６０ ~ ９５ ℃ )ꎮ 每个样品 ３
进行数据分析ꎮ 个独立的生物学重复ꎬ２ 个技术重复ꎮ 使用 ２ －ΔΔＣｔ
１.２ 欧耧斗菜 ＡＰ２/ ＥＲＦ 基因的鉴定及生物信息学分析 法计算基因的相对表达量ꎬｌｏｇ ( Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ) 进行
２
在 Ｔａｉｒ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ. ｏｒｇ / ) 上搜索 基因相对表达量(上调或下调)的标准化比较ꎮ
并下载拟南芥 ＡＰ２ / ＥＲＦ 家族的基因序列ꎬ作为参
考序列ꎮ 将转录组序列与拟南芥序列进行本地 表 １ 欧耧斗菜荧光定量检测引物序列
ＢＬＡＳＴ 比对ꎬＥ 值设置为 １ｅ￣５ꎬ将得到的核酸序列 Ｔａｂｌｅ １ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
通过 ＴＢｔｏｏｌｓ( Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０) 翻译为蛋白质序 ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｑｕｉｌｅｇｉａ ｖｕｌｇａｒｉｓ
列ꎬ提交 ＮＣＢＩ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ. ｇｏｖ / ) 和 引物名称 序列(５′￣３′)
ＳＭＡＲＴ( ｈｔｔｐ: / / ｓｍａｒｔ. ｅｍｂｌ￣ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ. ｄｅ / ) 预 测 结 Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′￣３′)
构域ꎬ保留 含 有 完 整 ＡＰ２ / ＥＲＦ 结 构 域 的 蛋 白 序 ＡｖＡＰ２ / ＥＲＦ￣５６Ｆ ＧＴＡＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣＣＣＴＣＧＴＴ
ＡｖＡＰ２ / ＥＲＦ￣５６Ｒ ＧＣＣＣＣＴＴＧＧＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＧ
列ꎮ 利 用 ＭＥＧＡ ７. ０ 软 件ꎬ 以 邻 接 法 ( ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣
ｊｏｉｎｉｎｇꎬ ＮＪ) 构建欧耧斗菜与拟南芥 ＡＰ２ / ＥＲＦ 基 ＡｖＡＰ２ / ＥＲＦ￣６１Ｆ ＧＣＧＡＡＧＴＡＧＡＣＧＣＡＡＴＧＧＡＣＣ
因的系统发育进化树ꎬ并使用 ｉＴＯＬ( ｈｔｔｐｓ: / / ｉｔｏｌ. ＡｖＡＰ２ / ＥＲＦ￣６１Ｒ ＡＧＣＴＧＧＣＡＣＴＴＴＡＣＧＡＣＧＣＴ
ｅｍｂｌ. ｄｅ / ) 进 行 美 化ꎮ 通 过 在 线 软 件 ｐＩ / Ｍｗ ＡｖＡＰ２ / ＥＲＦ￣８０Ｆ ＡＴＡＣＧＡＡＡＧＧＣＧＧＣＡＡＧＴＧＡ
(ｈｔｔｐ: / / ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.Ｏｒｇ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ / )分析蛋白质的 ＡｖＡＰ２ / ＥＲＦ￣８０Ｒ ＣＡＡＣＣＣＴＧＧＣＡＴＴＣＣＡＡＡＣＴＣ
分子量、氨基酸数目、等电点、平均亲水性等理化 ＩＰＰ２Ｆ ＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＧＡＣＴＧＡＡＧＴＴＡＴＣ
性质ꎬ利 用 在 线 软 件 ＭＢＣ ( ｈｔｔｐ: / / ｃｅｌｌｏ. ｌｉｆｅ. ｎｃｔｕ.
ＩＰＰ２Ｒ ＣＣＡＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣ
ｅｄｕ.ｔｗ / ) 进行亚细胞定 位ꎮ 利 用 在 线 网 站 Ｐｒａｂｉ
(ｈｔｔｐｓ: / / ｐｒａｂｉ.ｉｂｃｐ.ｆｒ / ｈｔｍ / ｓｉｔｅ / ｗｅｂ)预测蛋白质二
级结构ꎬ在 线 工 具 ＭＥＭＥ ( ｈｔｔｐ: / / ｍｅｍｅ￣ｓｕｉｔｅ. ｏｒｇ / ２ 结果与分析
ｔｏｏｌｓ/ ｍｅｍｅ)分析基因保守基序ꎬ并通过 ＴＢｔｏｏｌｓ 进
行可视化ꎮ ２.１ 转录组测序结果简介
１.３ 欧耧斗菜 ＡＰ２ / ＥＲＦ 基因表达模式分析 此次共获得转录组文库 １２ 个ꎬ过滤后每个文库
基于欧耧斗菜盐胁迫下转录组数据ꎬ将 ＡＰ２ / 至少获得 ４１ ５２１ ５０２ 个 ｃｌｅａｎ ｒｅａｄｓ、６. ２３ Ｇ ｃｌｅａｎ
ＥＲＦ 家族基因在盐胁迫 ０( ＣＫ)、１２、２４、４８ ｈ 的表 ｂａｓｅｓꎮ 所有 １２ 个文库中的 Ｑ３０ 均超过 ９４.８１％ꎬＧＣ
达量通过 ＦＰＫＭ( ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｍｉｌｌｉｏｎ) 标 均在 ４１.５１~４２.７２ 之间ꎬ共组装序列 ２８ ０８８ 个ꎮ 各
