Page 132 - 《广西植物》2023年第4期

Ꭾ ϟ ࿗ 广জ 西জ 植জ 物 ࿗ሕ 卷
规律ᖔ拟解决以下两个问题᧥ྉϟɯ茯苓木质纤维素降 ϓॹᇺ 序列扩增与系统发育分析
解酶能否通过最佳培养基及诱导条件产生纤维素 提取茯苓基因组 ᧕શዶᖔ灭菌刀具刮取约 ԰ԡ ቝ੫
酶ܦ半纤维素酶ܦ木质素降解酶及各酶类间有何差 新鲜菌丝ᖔ采用细胞破壁仪充分研磨粉末至细胞
异ଫྉ԰ɯ茯苓木质纤维素降解酶能否通过不同底物 破壁ᖔ按照真菌试剂盒ྉВશ᧧͐᥋ϟԡ 柱式ɯ 说明书提
的诱导来提高产酶能力及影响产酶规律ᖔ以期为今 取茯苓 ɟᣮϟ 基因组 ᧕શዶᤥ ۪ऊ኏ 采用通用引物对

后木质纤维素相关酶的应用提供理论基础ᤥ ྉ 吴悦妮 等ᖔ԰ԡ԰ԡ ɯᖔ 分别为 ᧧ఋ୩ϟ ྉ ጢࣕ᥋
ఋऊऊ᥈ఋዶ᥈᥈ఋ᥈ዶዶऊऊఋ᥈ऊ᥈᥈᥋ሕࣕɯ和 ᧧ఋ୩࿗ྉጢࣕ᥋ఋऊऊ᥈ऊ
ϟজ 材料与方法 ఋఋዶఋఋ᥈ዶఋዶఋ᥈ऊ᥋ሕࣕɯܦ શᓂϟྉጢࣕ᥋᥈ऊዶఋዶఋऊዶዶఋዶዶ᥈
ऊ᥈᥈ዶ᥈᥈ዶዶዶዶ᥈᥋ሕࣕɯ 和 શᓂ࿗ ྉጢࣕ᥋᥈᥈ఋऊऊ᥈ఋ᥈ఋఋఋऊ
ϓॹϓ 菌种来源 ዶዶ᥈ዶऊ᥈᥈᥋ሕࣕɯܦጶèϟ᥋ᤃऐऐèྉጢࣕ᥋ऊ᥈᥈ఋऊዶऊఋఋ᥈ዶఋऊఋ
野生茯苓ྉ ۩ᅳᤀஏᔠᡓᅳʗᔠᐹ ዞᅳዞᅳ໧ɯ 菌株于 ԰ԡ԰ԡ 年 ԰ ዶऊዶዶ᥈ఋ᥈ऊ᥋ሕࣕɯܦ ጶèϟ᥋ϟ԰ጢϟ኏ྉጢࣕ᥋ऊऊఋऊ᥈ዶዶऊఋऊዶऊ
月ᖔ采自安徽省安庆市岳西县中关镇请寨村林区 ऊዶ᥈ఋዶऊऊ᥈᥋ሕࣕɯᤥ ۪ऊ኏ 扩增体系为模板 ᧕શዶ ԡ঎ጢԡ
᥋ϟ
ྉϟϟᤃ๼ሕጢࣕ ጶܦሕԡ๼ऐጢࣕ શɯ腐朽的松树桩下茯苓菌核ᖔ ဂᓂᖔ引物 ϟԡ ဂቝᆍ᤟ኼ ᓂ 各 ϟ঎ Ꭾጢ ဂᓂᖔ԰ ġ ኏ᑕᡱᔽʛ ఋᑕी
经分离鉴定后现保存在安庆师范大学动植物检疫 ᥘᑕ༁ᡷᔀʢ ᥘᔽ଴ ԰ጢ঎ԡԡ ဂᓂᖔʛʛ̀ ᨃ 定容至 ጢԡ঎ԡԡ ဂᓂᖔ以
԰
实验室 ࿗ቩ 冰箱内ᖔ并进行甘油保藏ᤥ 液体茯苓 上 ሕ 种 ۪ऊ኏ 扩增反应条件相同ᖔ均为 ँ࿗ ቩ ጢ ቝᔽႿᖔ
菌丝 ɟᣮϟ 保藏在中国典型培养物保藏中心ᖔ保藏 ँ࿗ ቩ ሕԡ ༁ᖔጢ԰ ጲ ጢጢ ቩ 退火 ࿗ጢ ༁ᖔᎮ԰ ቩ ԰ ቝᔽႿᖔ共 ሕጢ
个循环ᖔᎮ԰ ቩ ϟԡ ቝᔽႿᖔ 终止 ࿗ቩ ᤥ ۪ऊ኏ 产物经
编号为 ऊऊఋऊऊ શᆍ᧥ᥘ ԰ԡ԰ϟ࿗ሕ࿗ᤥ
ϓॹԣ 培养基 ϟ঎԰ᠮ琼脂糖凝胶电泳检测并回收测序ᖔ将获得的
ɟᣮϟ 序列分别提交至 શऊା᧧ 的 ᥈ᔀႿାᑕႿҴᖔ 进行
固体 ۪᧕ዶ 培养基᧥去皮土豆 ԰ԡԡ ੫ᖔ葡萄糖 ԰ԡ
ାᓂዶ୩ఋ 比对ᖔ运用分析软件 ᥘጶ᥈ዶᤃ঎ϟ 中的 શȮ 法
੫ᖔ琼脂粉 ϟᎮ ੫ᖔ᣽̀ ۪ᨃ ሕ੫ᖔᥘ੫୩ᨃ ኼᎮ̀ ᨃϟ঎ጢ ੫ᖔ
԰ ࿗ ࿗ ԰ 构建 系统发育树 ྉ èᑕႿ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ ԰ԡϟጢଫ 张绍刚等ᖔ
定容至 ϟԡԡԡ ቝᓂᖔϟ԰ϟ ቩ 高压灭菌 ሕԡ ቝᔽႿᖔ用于茯
԰ԡ԰ϟɯᤥ
苓菌丝的培养ᤥ
ϓॹ྽ 菌株培养
刚果红初筛培养基᧥ 羧甲基纤维素钠 ԰੫ᖔ
木质纤维素降解酶系皆采用固体 ۪᧕ዶ 培养基
ᥘ੫୩ᨃ ኼᎮ̀ ᨃϟ঎ऐऐ ੫ᖔ᣽̀ ۪ᨃ ԡ঎ጢ ੫ᖔ蛋白胨 ԰੫ᖔ琼
进行培养ᖔ待菌丝即将长满平板时ᖔ使用打孔器进
࿗ ԰ ԰ ࿗
脂粉 ϟጢ ੫ᖔ定容至 ϟ ԡԡԡ ቝᓂᖔϟ԰ϟ ቩ高压灭菌 ሕԡ ቝᔽႿ
行打孔ᖔ每瓶种子培养基中含 ጢ 个孔径为 ϟዹቝ 菌
后备用ᖔ待菌落生长平皿 ጢዹቝ 时ᖔ向培养基中加入
᥋ϟ
饼ᖔ԰ऐ ቩ ܦϟጢԡ ʢኼቝᔽႿ 于恒温振荡培养箱内培养ᖔ
᥋ϟ
ϟቝ੫ኼቝᓂ 刚果红溶液ᖔ染色 ϟၤᖔ弃去染液后ᖔ加入
纤维素和半纤维素降解酶系测定中ᖔ酶液制备皆
᥋ϟ
ϟቝᆍ᤟ኼᓂ શᑕऊ᤟ 溶液ᖔ洗涤 ϟၤ 后观察结果ᖔ此培养
为待种子培养基内菌丝生长成熟ᖔ用移液枪吸取
基用于纤维素分解菌的定性培养和鉴别ᤥ
接种至纤维素酶产酶培养基ᖔ接种量为每瓶 ϟ঎ጢ
纤维素酶种子培养基᧥蛋白胨 ԰ԡ ੫ᖔ羧甲基纤
ቝᓂྉ邹荣松ᖔ԰ԡϟँɯᖔ木质素降解酶系检测使用分
维素钠 ϟԡ ੫ᖔશᑕऊ᤟ ጢ ੫ᖔ᣽̀ ۪ᨃ ϟ੫ᖔ用于纤维素酶
԰ ࿗ 别添加上文 ϟ঎԰ 项下 ࿗ 种不同底物的 ᓂશዶ୩ 培养
产酶种子菌摇瓶培养ᤥ 基ᤥ 在超净工作台内进行提取培养液即胞外酶
纤维素酶产酶培养基᧥蛋白胨 ϟԡ ੫ᖔ酵母膏 ϟጢ 液ᖔ纤维素酶系持续吸取至 ϟ԰ ʛᖔ木质素酶系持续
੫ᖔ羧甲基纤维素钠 ϟԡ ੫ᖔશᑕऊ᤟ ጢ ੫ᖔ᣽̀ ۪ᨃ ϟ੫ᖔ 吸取至 ԰ϟ ʛᖔ每次使用移液枪定时定量吸取培养
԰ ࿗
ᡱ̀ ᢉ Ꭾ 定容至 ϟԡԡԡ ቝᓂᖔ用于纤维素酶产酶菌摇 液 ϟ঎ጢ ቝᓂᖔ提取的粗酶液离心 ϟሕ ԰ԡԡ ʢኼቝᔽႿ ᖔጢ
᥋ϟ
瓶培养ᤥ ቝᔽႿᖔ并进行酶活测定ᤥ
ᓂશዶ୩ 培养基᧥液体培养基的制备ᖔ根据 ࿗ 组 ϓॹጇ 酶活测定
不同分 组 需求选择对应矿质溶液 ྉ᣽ᔽʢҴ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ 利用酶标仪ྉ ᥘࣼ᤟ᡷᔽ༁ҴᑕႿ ᥈ᨃ 全波长酶标仪ɯ 测
ϟँᎮऐଫ̀ᑕᡷᑕҴҴᑕ ᪲Вࣼ༁ᔽ᥋኏ᑕࣼ׹ᑕᖔ ϟँऐሕ ɯᤥ 分别为以下 定 ሕϟԡ ጲ ጢ࿗ԡ Ⴟቝ 波长范围下酶活力的大小ᤥ 葡萄
࿗ 种培养基᧥不添加 ᥘႿ୩ᨃ ኼ̀ ᨃ 的矿物元素溶液 糖标准曲线的 制 作᧥ 配制 ϟ঎ ԡܦԡ঎ Ꭾጢܦԡ঎ ጢܦԡ঎ ԰ጢܦԡ
࿗ ԰
ྉ无锰ᖔዶɯଫ添加 ᥘႿ୩ᨃ ኼ̀ ᨃ 的矿物元素溶液 ቝ੫ኼቝᓂ 葡萄 糖 标 准 液ᤥ᧕ 木糖标准曲线的制
᥋ϟ
࿗ ԰
ྉ含锰ᖔାɯଫ添加 ԰੫ 松木屑的矿物元素溶液ྉ 有松 作᧥将 ϟԡ ቝ੫ኼቝᓂ ᧕ 木糖标准液使用蒸馏水稀释
᥋ϟ
木屑ᖔऊɯଫ添加 ԰ᖔ ᤃ᥋二甲氧基苯酚的矿物元素溶 至 ϟ঎ԡܦԡ঎ऐܦԡ঎ᤃܦԡ঎࿗ܦԡ ቝ੫ኼቝᓂ 即为标准稀释液ᤥ
᥋ϟ
液ྉ加 ԰ᖔᤃ᥋᧕ᥘ۪ᖔ᧕ɯᖔ用于木质素降解酶的检测ᤥ 酶标仪预热 ሕԡ ቝᔽႿ 以上ᖔ调节波长至 ጢ࿗ԡ Ⴟቝᖔ蒸