Page 121 - 《广西植物》2024年第7期
P. 121
７ 期 林立等: 代谢组与转录组联合解析赤皮青冈叶片黄化变异机制 １ ３ ２ １
色ꎬ并于 ２０１８ 年底通过嫁接繁殖多株材料ꎬ其特 ３ ５００ Ｖ(正模式)和－３ ５００ Ｖ(负模式)ꎻ加热温度
异性状已连续 ４ 年表现稳定ꎮ 本研究以赤皮青冈 ４２５ ℃ ꎻ毛细管温度 ３２５ ℃ ꎻ鞘气流速 ５０ Ａｒｂꎻ辅助
黄化突变植株和正常植株的叶片为研究材料ꎬ采 气流速 １３ Ａｒｂꎻ扫描范围 ７０ ~ １ ０５０ ｍ / ｚꎻ一级分
用代谢组和转录学联用技术同时结合生理生化测 辨率 ６０ ０００ꎻ二级分辨率 ７ ５００ꎻ碰撞能分别为 ２０、
定ꎬ拟探讨:(１) 赤皮青冈变异植株金黄叶色表型 ４０、６０ ｅＶꎻ采用质谱连续扫描采集数据ꎮ
形成的生理机制ꎻ(２)变异植株叶色黄化的转录调 １.２.３ 数据分析 将原始数据导入 Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｖ２.２
控机制ꎮ 本研究可为金叶系园林植物的选育和遗 软件( ＷａｔｅｒｓꎬＵＳＡ)ꎬ通过与 ＨＭＤＢ、ＭＥＴＬＩＮ 等代
传改良提供参考依据ꎮ 谢数据库进行比对鉴定代谢物ꎮ 利用 Ｒ 软件包进
行代谢组数据分析和热图制作ꎬ对两组样品进行
１ 材料与方法 主成分分析( ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓꎬＰＣＡ) 和
正交偏最小二乘判别分析( ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｐａｒｔｉａｌ ｌｅａｓｔ
１.１ 试验材料 ｓｑｕａｒｅｓ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓꎬＯＰＬＳ￣ＤＡ)ꎬ得到模型
以赤皮青冈黄化( 突变体) 植株( ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆꎬ 的 变 量 权 重 值 ( ｖａｒｉａｂｌｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｉｎ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎꎬ
ＹＬ)和正常植株(ｎｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆꎬＮＹＬ)为研究材料ꎬ ＶＩＰ)ꎬ以 ＶＩＰ > １ꎬ Ｐ < ０. ０５ 且 ＦＣ ( ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ) >
两种材料均种植于宁波市农业技术推广总站林特 １.１０ 或 ＦＣ < ０.９１ 为标准筛选组间的显著差异代
基地(１２１°４２′２４″ Ｅ、２９°４８′４６″ Ｎ)ꎮ ２０２１ 年 ８ 月 谢物(ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｃｈａｎｇｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓꎬＳＣＭｓ)ꎬ通过
采集两种植株叶片样品( 图 １)ꎬ置于液氮速冻后 与 ＫＥＧＧ 数据库进行代谢途径富集ꎮ
置于－８０ ℃ 冰箱中保存备用ꎮ １.３ 转录组测序与数据处理
１.２ 代谢组分析 １.３.１ 转录组测序及文库构建 采集 ＹＬ 和 ＮＹＬ 的
１.２.１ 代谢物提取 称取 ５０ ｍｇ 样品至离心管ꎬ加入 新鲜叶片ꎬ参考陆小雨等(２０２０) 方法进行 ＲＮＡ 提
ＴＭ
４００ μＬ 的甲醇 ∶ 乙腈(Ｖ/ Ｖ ＝ １ ∶ １ꎬ含内标)提取液ꎮ 取和质控处理ꎮ 采用 Ｔｒｕｓｅｑ ＲＮＡ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐ Ｋｉｔ
用冷冻组织研磨仪(Ｗｏｎｂｉｏ￣９６ｃꎬ上海万柏生物科技 (Ｉｌｌｕｍｉｎａ)的方法构建文库ꎮ 用带 Ｏｌｉｇｏ( ｄＴ) 的磁
有限公司)进行研磨ꎬ提取液静置后在 ４ ℃ 条件下 珠分离 ｍＲＮＡꎻ将 ｍＲＮＡ 随机打断ꎬ在 ＳＭＡＲＴ 逆
１３ ０００ ｇ 离心 １５ ｍｉｎꎬ之后取上清液进行上机分析ꎮ 转录酶( ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅＴＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ) 作
ＹＬ 组和 ＮＹＬ 组各设置 ６ 个生物学重复ꎮ 每个样品 用下合成 ｃＤＮＡ 第 １ 条链ꎬ利用 ＲＮａｓｅＨ 将 ＲＮＡ 链
取 ２０ μＬ 上清液ꎬ混合后用于质控分析ꎮ 降解ꎬ合成 ｃＤＮＡ 第 ２ 条链ꎻ通过 Ｅｎｄ￣Ｒｅｐａｉｒ Ｍｉｘ
１.２.２ 代谢物检测 利用 Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 超 将双链 ｃＤＮＡ 补齐ꎬ其 ３′末端加 Ａ 处理后连接测
高 效 液 相 色 谱 ( ｕｌｔｒａ￣ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ 序接头ꎻ将 ｃＤＮＡ 进行 ＰＣＲ 富集ꎬ利用 ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙꎬＵＨＰＬＣ) 串联傅里叶变换质谱( Ｑ ｂｅａｄｓ 纯化产物ꎻ经过 ＴＢＳ￣３８０( Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ) 定量ꎬ按
Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ￣Ｘ ) 进 行 ＬＣ￣ＭＳ 分 析ꎮ 色 谱 柱: 数据比例混合上机ꎻ测序时通过 ｃＢｏｔ 平台完成桥
ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３ ( １００ ｍｍ × ２. １ ｍｍꎬ１. ８ 式 ＰＣＲ 扩 增ꎬ 生 成 簇 ( ｃｌｕｓｔｅｒｓ)ꎬ 利 用 ＩＩｌｕｍｉｎａ
μｍꎻＷａｔｅｒｓꎬＵＳＡ)ꎮ 液相条件:流动相 Ａ 为 ９５％水 ＋ Ｎｏｖｅｓｅｑ ６０００ 平台完成转录组测序ꎬ构建 Ｉｌｌｕｍｉｎａ
５％乙腈(含 ０.１％甲酸)ꎬ流动相 Ｂ 为 ４７.５％乙腈 ＋ ＰＥ 文库(读长 ２ ｂｐ × １５０ ｂｐ)ꎮ
４７.５％异丙醇 ＋ ５％水( 含 ０.１％甲酸)ꎮ 洗脱梯度 １.３. ２ 数 据 处 理 将 测 序 得 到 的 图 像 信 号 经
如下ꎮ 正离子模式:０ ｍｉｎꎬＡ / Ｂ( Ｖ / Ｖ) 为１００ ∶ ０ꎻ ＣＡＳＡＶＡ 碱基识别转换为原始数据(ｒａｗ ｄａｔａ)ꎬ经过
３.０ ｍｉｎꎬ为 ８０ ∶ ２０ꎻ４.５ ｍｉｎꎬ为 ６５ ∶ ３５ꎻ５.０ ｍｉｎꎬ为 质控获得高质量的干净数据(ｃｌｅａｎ ｄａｔａ)ꎮ 采用无
０ ∶ １００ꎻ６.３ ｍｉｎꎬ为 ０ ∶ １００ꎻ６.４ ｍｉｎꎬ为 １００ ∶ ０ꎻ 参考基因组的转录组分析ꎬ通过 Ｔｒｉｎｉｔｙ ｖ２.８.５ 软件
８.０ ｍｉｎꎬ 为 １００ ∶ ０ꎮ 负 离 子 模 式: ０ ｍｉｎꎬ Ａ / Ｂ (Ｇｒａｂｈｅｒｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１１)将 Ｃｌｅａｎ ｒｅａｄｓ 拼接成重叠群
(Ｖ / Ｖ) 为 １００ ∶ ０ꎻ１.５ ｍｉｎꎬ为 ９５ ∶ ５ꎻ２.０ ｍｉｎꎬ为 ( ｃｏｎｔｉｇ ) 和 单 一 序 列 ( ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ )ꎮ 此 后ꎬ 利 用
９０ ∶ １０ꎻ４.５ ｍｉｎꎬ为 ７０ ∶ ３０ꎻ５.０ ｍｉｎꎬ为 ０ ∶ １００ꎻ ＴｒａｎｓＲａｔｅ ｖ１.０.３(Ｓｍｉｔｈ￣ｕｎｎａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６) 和 ＣＤ￣ｈｉｔ
６.３ ｍｉｎꎬ为 １００ ∶ ０ꎻ６.４ ｍｉｎꎬ为 １００ ∶ ０ꎻ８.０ ｍｉｎꎬ为 ｖ４.５.７(Ｌｉ ＆ Ｇｏｄｚｉｋꎬ２００６) 对初始组装序列进行优
１００ ∶ ０ꎮ 柱温 ４０ ℃ ꎻ进样量 ３ μＬꎻ流速 ０.４ ｍＬ 化过滤ꎬ并利用 ＢＵＳＣＯ ｖ３.０.２ 软件( Ｓｉｍãｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ
ｍｉｎ ꎮ 质谱条件:电喷雾离子源( ＥＳＩ)ꎬ喷雾电压 ２０１５)再次评估ꎬ得到后续分析的最终转录本ꎮ
￣１
