Page 122 - 《广西植物》2024年第7期
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１ ３ ２ ２ 广 西 植 物 ４４ 卷
将转录本与 ６ 大数据库(ＮＲ、Ｓｗｉｓｓ￣Ｐｒｏｔ、Ｐｆａｍ、 分别占总变量的 ３７.３０％ 和 ２４.１０％ ( 图 ２:ＡꎬＢ)ꎮ
ｅｇｇＮＯＧ、ＧＯ 和 ＫＥＧＧ)比对以获取注释信息ꎮ 通过 ＯＰＬＳ￣ＤＡ 分析结果(图 ２:ＣꎬＤ)显示ꎬ两种离子模式
ＲＳＥＭ ｖ１.３.１ 软件(Ｌｉ ＆ Ｐｅｗｅｙꎬ ２０１１) 计算基因的 下差异代谢物 Ｒ 值均高于 Ｑ 值ꎬ并且 Ｑ 与 Ｙ 轴截
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ＴＰＭ 值(ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓꎬ每百万读段中 距小于 ０ꎬ说明样本数据描述良好ꎮ
来自于某转录本的读段数)ꎬ利用 ＤＥＳｅｑ２ ｖ１.２４.０ 在正、负离子模式下共鉴定出 ６１４ 个 ＳＣＭｓꎬ其
软件(Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１４) 筛选 ２ 个组的差异表达 中ꎬ正离子模式下 ２５７ 个ꎬ上调的有 １４８ 个ꎬ下调
基因( ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓꎬＤＥＧｓ)ꎬ将阈值 的有 １０９ 个ꎬ负离子模式下 ３５７ 个ꎬ上调的有 １４７
差异倍数 ＦＣ ≥ ２ 且修正 Ｐ 值(Ｐ ａｄｊｕｓｔ) < ０.０５ 作 个ꎬ下调的有 ２１０ 个(图 ２:ＥꎬＦ)ꎮ
为筛 选 标 准ꎮ 以 Ｐ ａｄｊｕｓｔ < ０. ０５ 为 标 准ꎬ 采 用 ２.１.２ 主要的 ＳＣＭｓ 分析 从 ６１４ 个 ＳＣＭｓ 中筛选
Ｇｏａｔｏｏｌｓ ｖ０.６.５ 软件(Ｋｌｏｐｆｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)进行 出相对含量前 ３０ 的差异代谢物ꎮ 由表 ２ 可知ꎬ黄酮
ＧＯ 富集分析和 ＫＥＧＧ 通路富集分析ꎬ筛选参与叶 类化合物有 ９ 种ꎬ均在 ＹＬ 组表达上调ꎬ以吡喃酮啡
色变化的关键基因ꎮ 肽 Ａ 上调最为显著ꎬ上调了 ２.２８ 倍ꎬ槲皮素 ３￣Ｏ￣
１.３.３ 代谢物与基因相关性分析 采用 Ｐｒｉｓｍ ８.０ (６″￣乙酰葡萄糖苷)也上调了 １.５５ 倍ꎻ５ 种核苷及其
(ＧｒａｐｈＰａｄꎬＵＳＡ)软件进行 ＳＣＭｓ 与 ＤＥＧｓ 的皮尔 衍生物在 ＹＬ 中有差异积累ꎬ其中 ２ 种嘧啶核苷显
森(Ｐｅａｒｓｏｎ) 相关性分析ꎮ 以 相 关 性 系 数 ｜ ｒ ｜ ≥ 著上调ꎬ３ 种嘌呤核苷显著下调ꎻ９ 种脂类代谢物中ꎬ
０.８ 且 Ｐ < ０.０５ 为阈值ꎬ得到 ＳＣＭｓ 与 ＤＥＧｓ 的分 有 ５ 种在 ＹＬ 中上调ꎬ主要为异戊烯醇脂类ꎻ２ 种有
子间相互作用关系数据ꎮ 机酸中ꎬ１ 种显著上调ꎬ另 １ 种显著下调ꎮ
１.３.４ ＲＴ￣ｑＰＣＲ 验 证 选 用 ８ 个 ＤＥＧｓ 进 行 ＲＴ￣ ２.１.３ ＳＣＭｓ 的 ＫＥＧＧ 通路分析 将 ＹＬ 和 ＮＹＬ 的
ｑＰＣＲ 来检 验 转 录 组 数 据 的 可 靠 性ꎬ利 用 Ｐｒｉｍｅｒ ＳＣＭｓ 进行 ＫＥＧＧ 富集分析ꎬ共富集到 ６６ 条通路ꎬ
Ｐｒｅｍｉｅｒ ５.０ 软件设计 ＰＣＲ 引物( 表 １)ꎮ 以 ＣＡＣｓ 主要包含甘油磷脂代谢、辅助因子生物合成、类黄
( Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＩＤ６７２８５００ ) 为 内 参 基 因 酮生物合成、ＡＢＣ 转运蛋白、异黄酮生物合成、氨
(Ｍａｒｕｍ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１２)ꎮ 设置 ３ 个生物学重复ꎮ 将 基糖和核苷酸糖代谢等 １３ 条代谢通路(图 ３)ꎮ 其
荧光定量表达水平进行 Ｌｏｇ 转换ꎬ与对应基因的 中ꎬ黄酮类生物合成富集的 ＳＣＭｓ 最多ꎬ包括类黄
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转录组表达丰度进行比较ꎮ 酮生物 合 成 富 集 １２ 个、异 黄 酮 生 物 合 成 富 集 ７
１.４ 叶绿素含量测定 个、黄酮和黄酮醇生物合成富集 ４ 个ꎬ说明黄酮类
取 ＹＬ 和 ＮＹＬ 的新鲜叶片ꎬ经过称量、研磨和 物质可能与 ＹＬ 叶色黄化有关ꎮ 此外ꎬ甘油磷脂代
过滤后ꎬ参照张丽霞等(２０２１) 的方法来测定两组 谢、辅酶合成代谢、ＡＢＣ 转运蛋白、氨基糖和核苷
叶片中的叶绿素含量ꎮ 设置 ３ 个生物学重复ꎮ 酸糖代谢、苯丙烷生物合成分别富集了 １７、１２、７、
１.５ 光合参数测定 ６、４ 个代谢物ꎮ
采用 ＣＩ￣３４０ 便 携 式 光 合 作 用 测 定 仪 ( ＣＩＤꎬ ２.２ 转录组测序结果与分析
ＵＳＡ)对 ＹＬ 突变体和 ＮＹＬ 植株叶片的净光合作 ２.２.１ 测序质量分析 对 ＮＹＬ 和 ＹＬ 材料的 ＲＮＡ
用、气孔导度、胞间 ＣＯ 浓度、蒸腾速率等光合参 进行转录组测序ꎬ质控后共获得 ４４.２６ Ｇｂ 干净数
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数进行测定ꎮ 设置 ３ 个生物学重复ꎮ 据(ｃｌｅａｎ ｄａｔａ) ( 表 ３)ꎮ 各样品的干净序列( ｃｌｅａｎ
ｒｅａｄ)条数在 ４３ ８６４ １２２ 和 ５６ ５９４ ９４４ 之间ꎬＱ２０
２ 结果与分析 值在 ９７.６１％ 和 ９７.７９％ 之间ꎬＱ３０ 值在９３.０３％ 和
９３.４９％之间ꎬＧＣ 碱基占比在 ４４.４９％ ~ ４４.９９％之
２.１ 代谢组测序结果与分析 间ꎬ满足于后续分析要求ꎮ
２.１.１ 代谢组的多元统计分析 对 ＹＬ 和 ＮＹＬ 两组 ２.２.２ 差异表达基因统计 从 ＹＬ 和 ＮＹＬ 的样品中
样本在正、负离子模式下的 ＵＨＰＬＣ￣Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ￣Ｘ 分别鉴定了 ４６ ３９１ 个和 ４８ ０１８ 个表达基因ꎬ其中
数据进行代谢物组成的多元统计分析ꎮ ＰＣＡ 分析 １６ ６９９个和 １５ ０７２ 个基因分别在 ＹＬ 和 ＮＹＬ 中特
结果显示ꎬ正离子模式下第 １ 主成分(ＰＣ１) 和第 ２ 异表达(图 ４:Ａ)ꎮ 以 ＮＹＬ 为对照组ꎬ在 ＹＬ 中共
主成分(ＰＣ２)分别占总变量的 ４０.６０％和１９.１０％ꎬ负 检测到 ４ １４６ 个 ＤＥＧｓꎬ其中 １ ７１１ 个上调ꎬ２ ４３５
离子模式下第 １ 主成分(ＰＣ１)和第 ２ 主成分(ＰＣ２) 个下调(图 ４:Ｂ)ꎮ
