Page 29 - 《广西植物》2025年第2期

２ 期 宋利沙等: 广西莪术叶枯病病原菌鉴定、生物学特性及室内药剂筛选 ２ ３ １

( Ｔ１ / ５′￣ＡＡＣＡＴＧＣＧＴＧＡＧＡＴＴＧＴＡＡＧＴ￣３′、 Ｂｔ￣２ｂ / ＰＤＡ 培养基为基础培养基ꎬ将 ２％添加量的葡萄糖
５′￣ＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＡＧＴＧＡＣＣＣＴＴＧＧＣ￣３′) ( Ｄｏｎｇ ｅｔ 替换为相同质量的蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀
ａｌ.ꎬ ２０２１)进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ挑取培养内生真菌的菌 粉、甘露醇、肌醇作碳源ꎻ以查氏培养基为基础培

落作为模板直接用于 ＰＣＲ 反应ꎬ扩增反应体系: 养基ꎬ将 ０.３％添加量的硝酸钠替换为相同质量的
２×ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ Ｂｕｆｆｅｒ ２５ μＬꎬ１０ × Ａｄｄｔｉｔｉｖｅ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ 硝酸钠、硫酸铵、半胱氨酸、蛋白胨、硝酸钾作为氮
Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ５ μＬꎬ引物 ＩＴＳ１ 和 ＩＴＳ２(１５ ｐｍｏｌ) 以及 源ꎮ 每皿放 １ 个菌饼ꎬ每个处理 ３ 次重复ꎬ放置 ２８

β￣微管蛋白 ＴＵＢ( Ｔ１ / Ｂｔ￣２ｂ) 各 １.５ μＬꎬ加 ｄｄＨ Ｏ ℃ 恒温培养箱中黑暗培养 ５ ｄꎬ观察菌落的形态ꎬ
２
定容 至 ５０ μＬꎮ ＰＣＲ 反 应 条 件: ９８ ℃ 预 变 性 ２ 采用十字交叉法测量菌落直径ꎮ
ｍｉｎꎬ９８ ℃ 变性 １０ ｓꎬ６０ ℃ 退火 １５ ｓꎬ６８ ℃ 延伸 ６０ １.２.５ 室内药剂筛选 采用菌丝生长速率法对广
ｓꎬ４０ 个循环ꎻ最后 ６８ ℃ 延伸 １０ ｍｉｎꎮ 空白对照为 西莪术叶枯病菌进行毒力测定ꎮ 将病原菌接种到
ｄｄＨ Ｏꎮ 利用 １.０％的琼脂糖凝胶电泳检测目的条 ＰＤＡ 培养基上培养 ５ ｄ 后ꎬ将菌饼(直径为 ６ ｍｍ)
２
带ꎬ将有目的条带的 ＰＣＲ 产物送至生工生物工程 按照供试药剂母液设定的浓度比例加入到已融化
(上海) 股 份 有 限 公 司 测 序ꎬ 所 得 序 列 在 ＮＣＢＩ 冷却至 ５０ ℃ 左右的 ＰＤＡ 培养基中ꎬ混匀后倒入无
ＧｅｎＢａｎｋ 进行 ＢＬＡＳＴ 比对ꎬ下载邻近属种序列( 表 菌培养皿中ꎬ制成含不同浓度药剂的平板( 以不加
２)ꎬ应用 ＭＥＧＡ ７.０ 软件邻接法( ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇꎬ 供试药剂的 ＰＤＡ 培养基作为空白对照)ꎬ在 ２８ ℃
ＮＪ)构建多基因系统发育树ꎮ 恒温培养箱中培养 ６ ｄꎬ每个处理 ３ 个重复ꎬ采用
１.２.４ 病原菌的生物学特性 选用广西莪术叶枯 十字交叉法测量菌落直径做好记录并计算抑菌
病病原菌进行生物学特性试验ꎬ设置培养基、温 率ꎮ 供试药剂浓度参照表 １ꎮ
度、光照、ｐＨ 值、碳源和氮源 ６ 个变量进行生物学 菌丝生长抑制率 ＝ [( 对照菌落直径－菌饼直
特性ꎬ参考曹秀秀(２０２１) 和但雨柔等(２０２３) 的设 径) －(处理菌落直径－菌饼直径)] / ( 对照菌落直
计ꎬ方法略有改进ꎮ 径－菌饼直径) ×１００％ꎮ
１.２.４.１ 不同培养基对病原菌生长的影响 马铃薯 利用 ＳＰＳＳ １９.０ 来计算 ＥＣ 值、斜率±标准误
５０
葡萄糖琼脂培养基( ＰＤＡ)、马铃薯蔗糖琼脂培养 差、卡方值、自由度和 Ｐ 值ꎮ
基(ＰＳＡ)、燕麦粉琼脂培养基( ＯＭＡ)、玉米粉琼脂 １.２.６ 实验数据处理 本实验的数据统计处理采
培养基(ＣＭＡ)和沙氏培养基( ＳＤＡ)ꎮ 将广西莪术 用 ＳＰＳＳ １９. ０ 进 行 单 因 素 方 差 分 析 ( ｏｎｅ￣ｗａｙ
病菌菌株组织块( 直径为 ６ ｍｍ) 接种于 ５ 种培养 ＡＮＯＶＡ)ꎬ选用 ＬＳＤ 和 Ｄｕｎｃａｎ’ ｓ 新复极差法进行
基的中 央ꎬ每 皿 置 放 １ 个 菌 饼ꎬ每 个 处 理 重 复 ３ 组间的多重比较ꎬ不同小写字母表示差异显著( Ｐ<
次ꎬ置于 ２８ ℃ 的培养箱中黑暗培养 ５ ｄꎬ采用十字 ０.０５)ꎮ 生物学特性的柱状图采用 Ｏｒｉｇｉｎ ２０１８ 软
交叉法测量菌落大小ꎬ找到最适培养基ꎮ 件进行制图分析ꎮ
１.２.４.２ 不同温度、光照及 ｐＨ 值对病原菌生长的
影响 在 ＰＤＡ 培养基上接种广西莪术病菌菌株组 ２ 结果与分析

织块(直径为 ６ ｍｍ) 分 别 置 于 ５、１０、１５、２０、２５、
２８、３０、３５、４０ ℃ 的培养箱里进行黑暗培养ꎻ光照设 ２.１ 广西莪术叶枯病症状及病原菌致病性测定

置处理为 Ｌ / Ｄ ＝ ２４ ｈ / ０ ｈ、Ｌ / Ｄ ＝ ０ ｈ / ２４ ｈ、Ｌ / Ｄ ＝ １２ 田间调查发现广西莪术叶枯病在老叶和嫩叶
ｈ / １２ ｈ ３ 种ꎬ温度设置为恒温 ２８ ℃ ꎻ用浓度为 １ 均可发病ꎬ一般从叶尖或叶缘开始发病ꎬ发病率
￣１ ３０％ ~ ５０％ꎮ 症状早期表现为叶片出现淡黄色斑
ｍｏｌＬ 的 ＨＣｌ 溶液和 ＮａＯＨ 溶液配制 ｐＨ 为 ２、３、
４、５、６、７、８、９、１０ 不同梯度的 ＰＤＡ 培养基ꎮ 各处 点ꎬ周围有黄色晕圈ꎬ随着病情的发展ꎬ病斑逐渐
理条件设置 ３ 个重复ꎬ每日观察ꎬ５ ｄ 后用十字交 由叶缘向叶片内部扩展ꎬ严重时扩展至整个叶片ꎬ

叉法测量菌落大小ꎮ 导致整株叶片发黄枯萎(图 １:Ａ、Ｂ)ꎮ
１.２.４.３ 不同致死温度对病原菌生长的影响 参考 从采集的 ５ 张病叶样品中共分离菌株 ８ 株菌
曹秀秀(２０２１)和但雨柔等(２０２３) 的方法ꎬ研究病 株ꎬ菌 落 形 态 为 白 色 絮 状ꎬ 分 离 率 最 高ꎬ 达 到
原菌菌落的致死温度ꎮ ８７.５％ꎬ将这 ８ 株都进行刺伤接种ꎬ发现只有分离
１.２.４.４ 不同碳源、氮源对病原菌生长的影响 以 频率最高的菌株 Ｅ￣１０ 成功侵染ꎬ 发病最快ꎮ 将菌