Page 125 - 《广西植物》2020年第1期
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１ 期 黄小龙等: 刺梨 ＧＬ２ 同源基因的克隆、系谱树和表达分析 １ ２ １
明ꎬＧＬ２ 是 ＧＬ１ 和 ＴＴＧ１ 的下游调控基因 (Ｐｅｓｃｈ ＆ (放入 ３６ ℃烘箱ꎬ放置 ３ ｄ 以上)洗涤ꎮ 将已固着和
Ｈüｌｓｋａｍｐꎬ ２０１１)ꎮ 修好的蜡块装在样品固定器上ꎬ并固定好ꎮ 将切片
本研究利用贵州省广泛种植的‘贵农 ５ 号’ 分 刀装在切片机上ꎮ 调节刀片的厚度为 ８~１５ μｍꎮ
离克隆与果刺发育有关的 ＲｒＧＬ２ꎬ对 ＲｒＧＬ２ 基因进 将切出的蜡带ꎬ平展于盒内以供展片ꎮ 之后
行了生物信息分析和时空表达检测ꎬ可为进一步研 经 显 微 镜 ( ＢＸ５３ꎬ Ｏｌｙｍｐｕｓꎬ Ｊａｐａｎ ) 观 察ꎬ ＳＰＯＴ
究刺梨果刺形成和发育的分子机制以及通过基因工 ＦＬＥＸ ＴＭ ＣＣＤ 拍摄(Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔꎬＵＳＡ)ꎮ
程培育刺梨无刺果实提供了遗传资源和理论基础ꎮ １.２ ＲＮＡ 提取和纯化
使用 Ｔｒｉｚｏｌ 试 剂 ( ＴａＫａＲａꎬ Ｊａｐａｎ) 提 取 茎、 叶
１ 材料与方法 片、花芽、种子和花后 ３ 周、５ 周和 ７ 周的皮刺部位
的总 ＲＮＡꎬ具体步骤参考试剂盒说明ꎮ 先用 ＤＮＡ
１.１ 植物材料和细胞学分析 酶(ＴａＫａＲａꎬＪａｐａｎ) 处理 ＲＮＡ 样品ꎮ 然后根据试
采集刺梨‘ 贵农 ５ 号’ 的叶片和果实后ꎬ一部 剂盒说明使用 ｏｌｉｇｏ ｄＴ － 接头引物的 ＲＴ￣ＰＣＲ Ｋｉｔ
分立即在液氮中冷冻并储存在 － ８０ ℃ ꎮ 选择叶、 (ＴａＫａＲａꎬＪａｐａｎ)将提取的 ＲＮＡ 进行逆转录ꎮ
幼果和成熟果实并收集花后 ３ 周、５ 周和 ７ 周的果 １.３ 分离 ＧＬ２ ｃＤＮＡ
刺以检测 ＲｒＧＬ２ 的表达水平ꎮ 另一部分通过体视 １.３.１ ３′ＲＡＣＥ 的合成 利用 ３′ ＲＡＣＥ(ＴａＫａＲａꎬＪａ￣
显微镜(ＳＺＸ７ꎬＯＬＹＭＰＵＳꎬＪａｐａｎ)观察并拍照ꎮ ｐａｎ)试剂盒以刺梨叶片提取的 ＲＮＡ 进行第一链
采摘不同时期的幼芽用 ＦＡＡ 固定液固定ꎬ先在 ｃＤＮＡ 合 成ꎮ 根 据 ＮＣＢＩ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ.
离心管中装入 ３ ｍＬ 固定液ꎬ将样品放入固定液中ꎬ ｎｉｈ.ｇｏｖ / )下载的其他生物所报道的与果刺发育有
封口膜封口ꎬ用解剖针在封口膜上扎几个小孔ꎬ然后 关的 ＧＬ２ 同源序列设计引物ꎮ 用引物进行两轮
抽真空ꎬ抽过真空后再加入 ２ ｍＬ 固定液(样品与固 ＰＣＲ 扩增基因的 ３′ 末端( 表 １)ꎮ 第一轮 ＰＣＲ:首
定液之比约为 １ ∶ ２０)ꎮ 若长期保存应将固定液换 先 ９４ ℃ 变性 ３ ｍｉｎꎬ然后进行 ２０ 个循环的扩增
成 ７０％酒精ꎬ４ ℃ 冰箱保存ꎮ 第 １ 天用 ７０％酒精过 (９４ ℃ ３０ ｓꎬ５５ ℃ ３０ ｓꎬ７２ ℃ ２ ｍｉｎ)和最后 ７２ ℃
夜ꎬ第 ２ 天用 ８５％酒精、９５％酒精、无水酒精、无水酒 延伸 １０ ｍｉｎꎮ 然后以第一轮 ＰＣＲ 产物作为第二次
精、１ / ５ 二甲苯、２ / ５ 二甲苯、３ / ５ 二甲苯、４ / ５ 二甲 ＰＣＲ 扩增的模板ꎬ并且在与第一轮 ＰＣＲ 相同的条
苯、纯二甲苯进行梯度洗脱ꎬ纯二甲苯处理后加碎蜡 件下运行 ３５ 个循环ꎮ
表 １ ＧＬ２ ｃＤＮＡ 克隆 ＲＡＣＥ 引物
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ＧＬ２ ｃＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｒｏｓａ ｒｏｘｂｕｒｇｈｉｉ
退火条件
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
引物 引物序列 (５′－３′) 应用
Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ (５′－３′) Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
温度 时间
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ (℃ ) Ｔｉｍｅ (ｍｉｎ)
ＲｒＧＬ２￣１ ＴＡＧＣＴＧＣＡＴＡＡＡＴＧＣＴＴＡＣＧ １ｓｔ ｏｆ ３′ ＲＡＣＥ ５５ ２
ＲｒＧＬ２￣２ ＡＡＴＣＧＣＡＧＧＡＡＣＧＡＧＴＧＧＧ ２ｎｄ ｏｆ ３′ ＲＡＣＥ ５５ ２
ＲｒＧＬ２￣３ ＧＧＧＧＴＧＡＣＴＣＣＴＴＧＡＡＣＡ ５′ ＲＡＣＥ ５５ ２
１.３.２ ５′ＲＡＣＥ 的合成 根据 ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤ￣ １.４ 克隆和测序
ＮＡ 扩增试剂盒 ( Ｎｏ. ６３４９２３ꎬＣｌｏｎｔｅｃｈ)ꎬ以叶片总 ＰＣＲ 产物用 １％琼脂糖凝胶检测ꎬ挖胶回收后
ＲＮＡ 为模板合成 ｃＤＮＡ 第一链ꎮ 按照上述 ３′末端 以 琼 脂 糖 凝 胶 ＤＮＡ 纯 化 试 剂 盒 ( ＤＶ８０５Ａꎬ
的序列合成基因特异性引物(表 １)进行 Ｔｏｕｃｈ￣ｄｏｗｎ ＴａＫａＲａꎬ Ｊａｎｐａｎ ) 纯 化ꎬ 克 隆 到 ｐＭＤ１８￣Ｔ 载 体
ＰＣＲ:首先(９４ ℃ꎬ３０ ｓꎻ７２ ℃ꎬ９０ ｓ)５ 个循环ꎬ然后 (ＴａＫａＲａꎬＪａｎｐａｎ) 中ꎬ最 后 热 激 法 转 化 大 肠 杆 菌
(９４ ℃ꎬ３０ ｓꎻ７０ ℃ꎬ３０ ｓꎻ７２ ℃ꎬ１ ｍｉｎ)５ 个循环ꎬ最后 ＤＨ５α 菌株( ＴｒａｎｓꎬＣｈｉｎａ)ꎮ 阳性克隆由上海生工
(９４ ℃ꎬ３０ ｓꎻ５５ ℃ꎬ２ ｍｉｎꎻ７２ ℃ꎬ２ ｍｉｎ)３０ 个循环ꎮ 生物工程技术服务有限公司(中国上海)测序ꎮ
