Page 126 - 《广西植物》2020年第1期

１ ２ ２ 广 西 植 物 ４０ 卷
１.５ 序列分析 进一步选取不同发育阶段的果实进行果刺数
使用 ＮＣＢＩ ＯＲＦ ｆｉｎｄｅｒ 对 ＰＣＲ 扩增获得的 ＧＬ２ 量和长度的统计ꎬ如表 ２ 所示ꎮ 选取花后 ３、５ 和 ７
开放阅读框片段进行分析ꎮ 通过 ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴｐ 获 周形成的果实ꎬ此时刺梨果实的直径分别是 １.５、
得 ＲｒＧＬ２ 同源蛋白ꎮ 使用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ 分析蛋白质 ２.３ 和 ３.４ ｃｍꎮ 将果实分为三个部位进行统计ꎬ分
的分子量、等电点和氨基酸组成ꎮ 用 ＰｒｏｔＳｃａｌｅ 的 别为上部、中部和下部ꎮ 从表 ２ 可以得到ꎬ在不同
Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ 方法预测这些蛋白质的亲水性或 的发育时期ꎬ果刺的数量均主要集中在中部ꎬ上部
疏水 性ꎮ ＴＭＨＭＭ ２. ０ 服 务 器 ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｃｂｓ. 和下部数量较少ꎮ 随着果实的发育ꎬ三个部位果
ｄｔｕ.ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＴＭＨＭＭ / ) 用于预测蛋白质的跨 刺的长度均发生显著性的增加ꎮ
膜结构域ꎮ ＳＭＡＲＴ 在线预测蛋白质结构域ꎮ ＥＳ￣ 刺梨经过一定时间的营养生长后ꎬ在外界各
Ｐｒｉｐｔ ３. ０ ( ｈｔｔｐ: / / ｅｓｐｒｉｐｔ. ｉｂｃｐ. ｆｒ / ＥＳＰｒｉｐｔ/ ＥＳＰｒｉｐｔ/ ) 因素达到一定要求时进入生殖生长阶段ꎬ这是刺
预测 蛋 白 质 二 级 结 构ꎮ Ｍｅｇａ６. ０ 软 件 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ 梨果实形成的必经阶段ꎮ 当刺梨进入生殖生长时
Ｊｏｉｎｉｎｇ 法用于构建系谱树ꎮ 期ꎬ刺梨茎端分生组织细胞开始分裂分化ꎬ在花的
１.６ 基因表达检测 发育过程中刺梨萼片上的刺细胞也开始不断发
使用 ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ 试剂 生ꎮ 花的发育是一个动态的过程ꎬ最初观察到花
盒在 ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ 仪器(ＲｏｃｈｅꎬＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ)中进 萼上有少量已经形成的刺结构ꎬ随着花的发育ꎬ萼
行 ＲｒＧＬ２ 的 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 检 测ꎮ β￣ａｃｔｉｎ 作 为 内 参 基 片上刺结构会成批次的产生ꎬ逐渐增多( 图 ２:Ａ)ꎮ

因ꎮ 引 物 为 ＲｒＧＬ２ꎬ Ｆｏｒｗａｒｄ (５′￣３′): ＣＧＡＧＧＣＡＧＴ￣ 当花的结构慢慢向外展开时ꎬ在花瓣原基基部处ꎬ
ＧＡＣＡＧＴＧＡＡＧＧꎻ Ｒｅｖｅｒｓｅ (５′￣３′): ＧＧＣＡＧＡＣＴＣＡＡ￣ 雄蕊原基开始慢慢发育形成一些粗而短的近似椭
ＣＡＧＡＣＴＣＣＡＴＡＧꎮ β￣ａｃｔｉｎ Ｆｏｒｗａｒｄ ( ５′￣３′): ＣＣＧＣ￣ 圆形的结构ꎬ刺原基突起内的基本分生组织细胞
ＣＡＴＧＴＡ ＴＧＴＴＧＣＣＡＴＣＣꎻ Ｒｅｖｅｒｓｅ (５′￣３′): ＡＧＣＣＡＧ￣ 进行切向分裂ꎬ细胞数目开始增加ꎬ表皮上的细胞
ＧＴＣＡＡＧＡＣＧＣＡＧＡＡＴꎮ 也进行分裂以适应刺的向外延伸( 图 ２:Ｂ)ꎮ 基部
ｑＲＴ￣ＰＣＲ 程序根据 ＳＹＢＲ 说明书进行ꎬ扩增 内的细胞迅速分裂使基部扩展变大ꎬ中部细胞增
进行 ４０ 个循环:在 ９５ ℃ 变性 ３０ ｓꎬ在 ５５ ℃ 退火 多ꎬ形态也发生变化ꎬ椭圆形的细胞开始变细、变
３０ ｓꎬ并在 ７２ ℃ 延伸 １ ｍｉｎꎮ 相对于对照的表达水 长ꎬ尖端呈“针”状型结构ꎬ刺结构的整体外形初步
平通过计算△△Ｃｔ[( △△Ｃｔ ＝ ｓａｍｐｌｅ △Ｃｔ－ｃｏｎｔｒｏｌ 形成(图 ２: Ｃ)ꎮ
△Ｃｔ)ꎬ △Ｃｔ ＝ ＲｒＧＬ２ Ｃｔ － ( β － ａｃｔｉｎ) Ｃｔ]ꎬ然 后 用 ２.２ 刺梨 ＲｒＧＬ２ 的序列分析
－△△Ｃｔ
２ 方法分析ꎮ 以‘贵农 ５ 号’ 的 ＲＮＡ 为模板ꎬ通过 ＲＡＣＥ 方
１.７ 统计分析 法得到 ＲｒＧＬ２ 的全长 ｃＤＮＡꎮ ＲｒＧＬ２( Ｇｅｎｅｂａｎｋ 登
本研究中的所有数据均为三次生物学重复的 录号:ＭＧ３８６４９８) 的全长为２ ２９２ ｂｐꎬ编码 ７６３ 个
平均值和相应的标准偏差表示ꎮ 使用 ＳＰＳＳ 单因 氨基酸ꎮ ＢＬＡＳＴ 分析表明ꎬ刺梨的 ＲｒＧＬ２ 序列和
素方差分析方法分析获得的数据ꎬＤｕｎｃａｎ 多重检 野草莓( Ｆｒａｇａｒｉａ ｖｅｓｃａ)、碧桃( Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ)、苹
验以比较统计显著性差异(Ｐ<０.０５)ꎮ 果(Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ)、麻风树(Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ)和桑
(Ｍｏｒｕｓ ｎｏｔａｂｉｌｉｓ) ＧＬ２ 具有较高的同源性ꎬ分别是
２ 结果与分析 ９６％、８８％、８６％、７８％和 ８０％的相似性ꎮ

ＰｒｏｔＰａｒａｍ 分析 ＲｒＧＬ２ 得到其分子量为 ８.４９
２.１ 刺梨不同组织的观察和早期细胞学研究 ｋＤａꎮ ＲｒＧＬ２ 的 等 电 点 是 ５. ７３ꎮ ＲｒＧＬ２ 含 有
分别选 取 刺 梨 的 不 同 部 位 观 察ꎬ 如 图 １ 所 １３.７６％的 酸 性 氨 基 酸、 １３. ６３％ 的 碱 性 氨 基 酸、
示ꎬ包括的组织有茎( 图 １:Ａ) 、叶( 图 １:Ｂ) 、花芽 ３８.７９％的疏水性氨基酸、２７.３９％的带电荷氨基酸
( 图 １:Ｃ) 、果实( 图 １:Ｄ) 和种子( 图 １:Ｅ) ꎮ 在茎 和６１.０７％的极性氨基酸ꎮ ＰｒｏｔＳｃａｌｅ 分析 ＲｒＧＬ２ 得
和果实的组织表面上观察到有一些坚硬的刺ꎬ分 到其亲水性氨基酸的数量明显大于疏水性氨基酸
别为枝刺和果刺ꎮ 在花芽最外的部位也存在少 的数量ꎬ且亲水性的平均值为－０.５２５ꎬ表明 ＲｒＧＬ２
量刺的 形 态ꎬ 叶 片 和 种 子 外 表 面 没 有 出 现 坚 硬 编码的蛋白质为可溶性蛋白质ꎮ ＴＭＨＭＭ２.０ 预测

的刺ꎮ 表明 ＲｒＧＬ２ 不含有跨膜结构域ꎮ