Page 64 - 《广西植物》2020年第2期

２ 期 王伟妍等: 滇龙胆 ８￣羟香叶醇氧化还原酶基因的克隆与表达分析 ２ ０ １

(Ｇｒ８ＨＧＯ￣５)ꎬ ｓｅｐａｒａｔｅｌｙ. (２) Ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ Ｇｒ８ＨＧＯ￣１ ｇｅｎｅ ｗａｓ １ ０６２ ｂｐ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ３５３ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓꎬ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ
ｆｏｕｒ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ １ １３１ ｂｐ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ３７６ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓꎻ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｆｉｖｅ Ｇｒ８ＨＧＯ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ ４０ ｋＤꎬ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｐＩ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ５.４７ ｔｏ
５.９５ꎬ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ａｌｌ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｓｔａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ. (３) Ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｆｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｉｄ ｎｏｔ ｃｏｎｔａｉｎ
ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓꎬ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｈｅｌｉｘｅｓ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅｓꎻ Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ
ｔｈｅｓｅ ｆｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍꎻ Ｄｏｍａｉｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｂｅｓｉｄｅ ｔｈｅ Ｇｒ８ＨＧＯ￣１ ｃｏｎ￣
ｔａｉｎｅｄ ｏｎｌｙ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ｎ￣ｔｅｒｍｉｎａｌ (ＩＰＲ０１３１５４) ａｎｄ Ｃ￣ｔｅｒｍｉｎａｌ (ＩＰＲ０１３１４９) ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎｓꎬ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ
ｆｏｕｒ ａｌｓｏ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅꎬ ｅｎｏｙｌｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｄｏｍａｉｎ (ＩＰＲ０２０８４３). (４) Ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ
ｔｈｅｓｅ ｆｉｖｅ Ｇｒ８ＨＧＯ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｈａｄ ｔｈｅ ｃｌｏｓｅｓｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ Ｃｒ８ＨＧＯ ｉｎ Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ. (５) Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｑＰＣＲ
ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ Ｇｒ８ＨＧＯ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｍａｉｎｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｌｅａｖｅｓꎬ ｂｕｔ ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｉｎ ｒｏｏｔｓ ａｎｄ ｓｔｅｍｓ. Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗｉｌｌ ｌａｙ ａ ｆｏｕｎ￣
ｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｇｅｎｔｉｏｐｉｃｒｏｓｉｄｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｇｅｎｔｉａｎａ ｒｉｇｅｓｃｅｎｓꎬ ８￣ｈｙｄｒｏｘｙｇｅｒａｎｉｏｌ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅꎬ ｃｌｏｎｉｎｇꎬ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓꎬ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

滇 龙 胆 ( Ｇｅｎｔｉａｎａ ｒｉｇｅｓｃｅｎｓ) 为 龙 胆 科 ( Ｇｅｎ￣ 种植物中分离ꎮ 但是ꎬ目前 ８ＨＧＯ 基因仅在长春花
ｔｉａｎａｃｅａｅ)龙胆属( Ｇｅｎｔｉａｎａ) 植物ꎬ主要分布于我 中的研究最为清楚ꎮ 在长春花中ꎬＣｒ８ＨＧＯ 蛋白在
国西南地区的云南、四川、贵州等地( 中国植物志 ８￣羟香叶醇、８￣羟香叶醛、８￣氧香叶醇、ＮＡＤ 存在
＋
编委会ꎬ １９８８)ꎮ 在传统中药中ꎬ滇龙胆药用部位 的条件下ꎬ根据组合和培养时间的不同ꎬ产生以上
为根ꎬ具有清热燥湿、泻肝胆火的作用( 国家药典 三种复合物和 ８￣氧香叶醛的混合物的相对比例不
委员会ꎬ ２０１５)ꎮ 现代研究表明滇龙胆根部主要药 同ꎬ因此ꎬ该酶被命名为 ８￣羟香叶醇氧化还原酶
＋
用成分为一种单萜类化合物龙胆苦苷( Ｚｈａｎｇ ｅｔ (图 １) ( Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１４)ꎮ 在 ＮＡＤ 辅因子
ａｌ.ꎬ ２０１５ꎻ 张晓东等ꎬ ２０１６)ꎮ 在植物中ꎬ龙胆苦 存在下ꎬＣｒ８ＨＧＯ 蛋白不能转换 ８￣氧香叶醛ꎬ在辅
苷的生物合成可分为三个阶段ꎮ 第一阶段是由质 因子 ＮＡＤＰ / ＮＡＤＰＨ 存 在 下ꎬＣｒ８ＨＧＯ 蛋 白 不 能
＋
体 ２￣Ｃ￣甲基￣Ｄ￣赤藓糖醇￣４￣磷酸( ＭＥＰ) 途径和胞 催化 ８￣羟香叶醇、８￣羟香叶醛、８￣氧香叶醇三个底
质甲羟戊酸(ＭＶＡ)途径合成原料异戊二烯焦磷酸 物(Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１４)ꎮ 有趣的是ꎬＣｒ８ＨＧＯ 蛋

(ＩＰＰ)和二甲基丙烯基焦磷酸( ＤＭＡＰＰ) ( Ｈｕａ ｅｔ 白对香叶醇、反式￣２￣己烯醇、法尼醇、橙花醇、异苯
ａｌ.ꎬ ２０１４)ꎻ第二阶段是以 ＩＰＰ 和 ＤＭＡＰＰ 为原料ꎬ 基苄醇、 辛 醇 等 初 级 醇 也 具 有 相 对 较 高 的 活 性
经过缩合、氧化、还原、糖基化、甲基化等步骤ꎬ生 (Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１４)ꎮ 由于存在 ４ 种相互转化

成裂环番木鳖苷( Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１４ꎻ Ｍｕｎｋｅｒｔ 的化合物和 ８ 种可能的反应ꎬ反应动力学相当复
ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５)ꎻ第三阶段是是萜类化合物经过修饰 杂ꎬ因 此 反 应 常 数 无 法 确 定 ( Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ
形成龙胆苦苷( 黄璐琦和刘昌孝ꎬ ２０１５)ꎮ ８￣羟香 ２０１４)ꎮ 在基因表达方面ꎬ长春花 Ｃｒ８ＨＧＯ 基因的

叶醇氧化还原酶(８￣ｈｙｄｒｏｘｙｇｅｒａｎｉｏｌ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅꎬ 表达受非生物因素的影响ꎮ 在长春花悬浮培养细
ＥＣ １. １. １. ３２４ꎬ 在 已 报 道 文 献 中 简 写 为 ８ＨＧＯ、 胞中ꎬＣｒ８ＨＧＯ 基因能够被茉莉酸甲酯( ＭｅＪＡ) 强
１０ＨＧＯ)是龙胆苦苷生物合成途径第二阶段中的 烈诱导表达ꎻ而在幼苗中ꎬＣｒ８ＨＧＯ 基因在 ＭｅＪＡ 处

第四个催化酶ꎬ能够催化 ８￣羟香叶醇、８￣羟香叶醇、 理 ６ ｈ 后被轻微诱导表达ꎻ在悬浮细胞中过表达
８￣氧香 叶 醛 和 ８￣氧 香 叶 醛 之 间 的 转 化 ( Ｉｋｅｄａ ｅｔ ＯＲＣＡ２(硬脂酸应答的长春花花分生组织决定基
ａｌ.ꎬ １９９１ꎻ Ｓａｌｉｍ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３ꎻ Ｄｅ Ｌｕｃａ ｅｔ ａｌ.ꎬ 因 ２ / 乙烯响应因子)并不能诱导 Ｃｒ８ＨＧＯ 的表达ꎬ
２０１４ꎻ Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１４ꎻ Ｄｕｇé Ｄｅ Ｂｅｒｎｏｎｖｉｌｌｅ 过表 达 ＯＲＣＡ３ 反 而 抑 制 Ｃｒ８ＨＧＯ 基 因 的 表 达
ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５ꎻ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５ꎻ Ｐａｄｈａｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５ꎻ (Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１４)ꎮ 在 ＵＶ￣Ｂ 胁迫 １５ ｍｉｎ 和
Ｃａｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６ꎻ Ｒａｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７)ꎮ ６０ ｍｉｎ 下ꎬ长春花幼苗叶片中 Ｃｒ１０ＨＧＯ 基因表达
鉴于 ８ＨＧＯ 在 单 萜 生 物 合 成 中 的 重 要 性ꎬ 上调 ０.７５ 倍ꎻ 在 ＵＶ￣Ｂ 胁 迫 后ꎬ 黑 暗 培 养 ７２ ｈꎬ
８ＨＧＯ 基因已从长春花(Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１４)、喜 Ｃｒ１０ＨＧＯ 蛋白含量是对照组的 １.９８ 倍ꎬ其下游产

树(Ｖａｌｌｅｔｔａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１０)、川西獐牙菜( Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ 物异胡豆苷增加约 ５ 倍(Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５)ꎮ
２０１７)、秦艽( Ｃａｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６)、大花胡麻草等多 为了探究滇龙胆 Ｇｒ８ＨＧＯ 基因是否参与龙胆