Page 65 - 《广西植物》2020年第2期

２ ０ ２ 广 西 植 物 ４０ 卷
ｃＤＮＡ 为模板进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ扩增产物经回收后
克隆到 ｐＭＤ１９￣Ｔ 载体( Ｔａｋａｒａꎬ大连)ꎮ 转化大肠
杆菌 ＤＨ５α 感受态细胞(Ｔａｋａｒａꎬ大连)后ꎮ 挑取菌
落后ꎬ提质粒ꎬ经双酶切检测正确后送生工生物工
程上海股份有限公司进行 ＤＮＡ 测序ꎬ获得重组质
粒 ｐＭＤ１９￣Ｇｒ８ＨＧＯꎮ
１.２.２ 原核表达载体构建 使用双酶切、连接的方
法构建原核表达载体 ｐＥＴ３２ａ￣Ｇｒ８ＨＧＯ( 张晓东等ꎬ
２０１６)ꎮ
１.２.３ Ｇｒ８ＨＧＯ 基因及其编码蛋白的序列分析 使
用 ＮＣＢＩ￣ＢＬＡＳＴｐ 软件进行蛋白同源性比对ꎬ使用
图 １ Ｇｒ８ＨＧＯ 酶催化的反应
离线 软 件 ＤＮＡＭＡＮ ７ 进 行 多 序 列 比 对ꎻ 使 用
Ｆｉｇ. １ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ Ｇｒ８ＨＧＯ ｅｎｚｙｍｅ
ＭＥＧＡ Ｘ 离线软件的 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ 进行多序列比对ꎬ
然后使用 ＮＪ 法创建系统发育树ꎬＢｏｏｔｓｔｒａｐ ＝ １ ０００ꎻ
苦苷生物合成、其他单萜的生物合成等代谢过程ꎬ 利用网络软件对基因稀有密码子进行分析( 张晓
为龙胆苦苷和单萜类生物合成提供优质基因资 东等ꎬ ２０１６)ꎮ 使用 ＣｈｌｏｒｏＰ ｖ１.１ 预测叶绿体转运
源ꎬ本研究根据前期本课题组的滇龙胆叶和根的
肽ꎻ使用在线 ＩｎｔｅｒＰｒｏ 软件预测蛋白保守结构域ꎻ
转录组数据库ꎬ设计引物ꎬ对滇龙胆 Ｇｒ８ＨＧＯ 基因 使用在线软件 ＰｒｏｔＳｃａｌｅ 分析蛋白的亲疏水性ꎻ使
进行克隆ꎬ并进行序列分析、原核表达载体构建和 用在线软件 ＳＰＯＭＡ 预测蛋白的二级结构ꎻ使用在
组织器官特异性表达分析ꎬ为今后阐明 Ｇｒ８ＨＧＯ 基
线软件 Ｐｈｙｒｅ２ 预测蛋白的三级结构ꎻ使用 ＳＷＩＳＳ￣
因在龙胆苦苷合成中的作用奠定基础ꎮ
ＭＯＤＥＬ 进行同源建模分析ꎻ利用 Ｅｘｐａｓｙ 中的 ＴＭ￣
ＨＭＭ 服务器 Ｖ２.０ 预测蛋白的跨膜螺旋区ꎻ利用
１ 材料与方法 Ｐｌａｎｔ￣ｍＰＬｏｃ、ＷＯＬＦ ＰＳＯＲＴ 和 ＰｒｏｔＣｏｍｐ ９. ０ 三 个

软件对蛋白的亚细胞定位情况进行预测ꎮ
１.１ 材料 １.２.４ Ｇｒ８ＨＧＯ 基因的表达分析 分别提取两年生滇
滇龙胆(Ｇｅｎｔｉａｎａ ｒｉｇｅｓｃｅｎｓ)植株采自于临沧耀 龙胆的根、茎和叶的总 ＲＮＡꎬ使用反转录试剂盒 Ｐｒｉ￣
阳生物医药有限公司后箐基地ꎬ种植于玉溪师范 ｍｅＳｃｒｉｐｔ ＴＭ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ (Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ)(Ｔａｋａ￣
学院后勤基地ꎮ 使用滇龙胆幼叶进行 ＲＮＡ 提取ꎬ ｒａꎬ大连)合成第一链 ｃＤＮＡꎮ 根据 Ｇｒ８ＨＧＯ 基因序
使用土壤栽培两年生滇龙胆的根、茎和叶进行基 列 设 计 一 对 特 异 性 引 物 ｑＧｒ８ＨＧＯ￣Ｆ ( ５′￣ＡＧＧＡ￣

因表达分析ꎬ取样日期为 ２０１８ 年 ４ 月 ３０ 日ꎮ ＣＡＡＡＣＡＧＴＧＴＡＣＣＡＣＣ￣３′) 和 ｑＧｒ８ＨＧＯ￣Ｒ ( ５′￣
１.２ 方法 ＣＡＡＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＣＣ￣３′)ꎬ用于所有 Ｇｒ８ＨＧＯ
１.２.１ 叶片总 ＲＮＡ 提取、反转录及 Ｇｒ８ＨＧＯ 基因 基因的表达分析ꎮ 以滇龙胆 ＧｒＡＣＴＩＮ 基因为内参ꎬ

ＯＲＦ 的 克 隆 使 用 植 物 ＲＮＡ 提 取 试 剂 盒 使用嵌合荧光检测试剂盒 ＴＢ Ｇｒｅｅｎ ＴＭ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ
ＴＭ
ＭｉｎｉＢＥＳＴ Ｐｌａｎｔ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ( Ｔａｋａｒａꎬ大连) Ｔａｑ Ⅱ(Ｔａｋａｒａꎬ大连)进行 ｑＰＣＲꎮ 每个反应重复 ３
进行滇龙胆幼叶总 ＲＮＡ 的提取ꎻ使用逆转录试剂 次ꎮ 反应在 ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ® ４８０ Ⅱ荧光定量 ＰＣＲ 仪
ＴＭ
盒 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ⅱ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ (Ｒｏｃｈｅꎬ瑞士)上进行扩增ꎬ扩增结果使用内参基因
－△△ Ｃｔ
(Ｔａｋａｒａꎬ大连) 进行 ｃＤＮＡ 的合成ꎮ 参照 ｐＥＴ３２ａ 校准后ꎬ采用比较 Ｃｔ 值的“２ ”的方法自动计算
原核表达载体的多克隆位点和滇龙胆转录组数据 出根、茎、叶中 Ｇｒ８ＨＧＯ 基因相对表达量ꎮ
库中 Ｇｒ８ＨＧＯ 基 因 序 列ꎬ 设 计 一 对 特 异 性 引 物
２ 结果与分析
Ｇｒ８ＨＧＯＢａｍＨＩ￣Ｆ:ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣＴＡＡＡＡＣＣＡＴＴＡ
ＣＴＣＣＴＧＣ ( 下 划 线 为 ＢａｍＨＩ 酶 切 位 点 )ꎬ
Ｇｒ８ＨＧＯＸｈｏＩ￣Ｒ:ＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＡＣＴＴＡＡＴＴＡＣＡＡ ２.１ 滇龙胆 Ｇｒ８ＨＧＯ 基因序列的克隆
ＣＣＴＴＡＡＣＡＣ(下划线为 ＸｈｏＩ 酶切位点)ꎮ 以上述 以逆转录获得的 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ使用基因特异