Page 67 - 《广西植物》2020年第2期
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２ ０ ４ 广 西 植 物 ４０ 卷
Ｇｒ８ＨＧＯ 蛋白与 Ｃｒ８ＨＧＯ 蛋白的叶绿体转运肽进
行预测ꎬ结果表明这些蛋白不包含叶绿体转运肽
(表 ２)ꎮ
使用 Ｐｌａｎｔ￣ｍＰＬｏｃ 软件和 ＰｒｏｔＣｏｍｐ ９.０ 软件
进行亚细胞定位分析ꎬ结果是 ５ 个 Ｇｒ８ＨＧＯ 蛋白
和 Ｃｒ８ＨＧＯ 蛋白均定位于细胞质 (表 ３)ꎮ 而使用
ＷＯＬＦ ＰＳＯＲＴ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ 软件进行亚细胞定位分析
的结果是这些蛋白最可能为分泌蛋白(表 ３)ꎮ
利用 ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ Ｗｏｒｋｓｐａｃｅ 的自动模式预
图 ３ Ｇｒ８ＨＧＯ 蛋白与其他植物 测 ５ 个 Ｇｒ８ＨＧＯ 蛋白和 Ｃｒ８ＨＧＯ 蛋白的三级结构ꎬ
８ＨＧＯ 蛋白的系统发育分析
结果如表 ４ꎬ表明滇龙胆 ５ 个 Ｇｒ８ＨＧＯ 蛋白属于Ⅱ
Ｆｉｇ. ３ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｒ８ＨＧＯ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
类乙醇脱氢酶ꎬ而长春花 Ｃｒ８ＨＧＯ 属于Ⅲ类乙醇
ａｎｄ ８ＨＧＯ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｏｔｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ
脱氢酶(图 ４)ꎮ 与其他蛋白相比ꎬＧｒ８ＨＧＯ￣１ 蛋白
在 Ｎ 末端缺失 ２３ 个氨基酸ꎬ导致其在三维结构模
使 用 Ｅｘｐａｓｙ ＰｒｏｔＰａｒａｍ 工 具 对 ５ 个 Ｇｒ８ＨＧＯ 型上表现为蛋白左上侧的 β 片层结构减少(图 ４)ꎮ
蛋白和 Ｃｒ８ＨＧＯ 蛋白的理化性质进行分析ꎬ结果 使用 ＩｎｔｅｒＰｒｏ７１.０ 在线软件对 ５ 个 Ｇｒ８ＨＧＯ 蛋
表明 在 Ｎ 端 部 分 Ｇｒ８ＨＧＯ￣１ 蛋 白 比 其 他 ４ 个 白和 Ｃｒ８ＨＧＯ 蛋白进行保守结构域分析ꎬ结果表
Ｇｒ８ＨＧＯ 蛋白少 ２３ 个氨基酸ꎬ后 ４ 个 Ｇｒ８ＨＧＯ 蛋 明 Ｇｒ８ＨＧＯ￣１ 蛋白仅包含乙醇脱氢酶 Ｎ 端结构域
白与 Ｃｒ８ＨＧＯ 蛋白大小相似( 表 １)ꎮ 与 Ｃｒ８ＨＧＯ (ＩＰＲ０１３１５４)和 Ｃ 端结构域( ＩＰＲ０１３１４９)ꎬ而后 ４
相比ꎬ５ 个 Ｇｒ８ＨＧＯ 蛋白带正负电荷的氨基酸残基 个 Ｇｒ８ＨＧＯ 蛋白和 Ｃｒ８ＨＧＯ 蛋白除具有以上两个
数目相差较大ꎬ导致其理论 ｐＩ 更偏酸性( 表 １)ꎮ ５ 保守结构域外ꎬ还具有聚酮合酶、烯酰还原酶结构
个 Ｇｒ８ＨＧＯ 蛋白与 Ｃｒ８ＨＧＯ 都为疏水稳定蛋白ꎬ但 域(ＩＰＲ０２０８４３) ( 表 ５)ꎮ 在 催 化 Ｚｎ 结 合 位 点 方
是前者的疏水性更强( 表 １)ꎮ 使用 ＰｒｏｔＳｃａｌｅ 软件 面ꎬＧｒ８ＨＧＯ￣１ 仅 具 有 ２ 个 结 合 位 点ꎬ 而 后 ４ 个
对 ５ 个 Ｇｒ８ＨＧＯ 蛋白与 Ｃｒ８ＨＧＯ 蛋白进行疏水性 Ｇｒ８ＨＧＯ 蛋白和 Ｃｒ８ＨＧＯ 蛋白具有 ４ 个结合位点ꎻ
分析ꎬ 结 果 与 表 １ 一 致ꎮ ５ 个 Ｇｒ８ＨＧＯ 蛋 白 与 在结构 Ｚｎ 结合位点方面ꎬ所有蛋白都具有 ４ 个结
Ｃｒ８ＨＧＯ 蛋白在大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞 合位点ꎻ在 ＮＡＤ 结合位点方面ꎬＧｒ８ＨＧＯ￣１ 仅具有
体内的半衰期都分别大于 １０、 ２０ 和 ３０ ｈꎮ 对 ５ 个 ２０ 个结合位点ꎬ而后 ４ 个 Ｇｒ８ＨＧＯ 蛋白和 Ｃｒ８ＨＧＯ
Ｇｒ８ＨＧＯ 基因进行稀有密码子分析ꎬ结果显示这些 蛋白则具有 ２２ 个结合位点ꎻ在底物结合位点方
基因中稀有密码子含量均低于 ０.８５％ꎬ且无稀有 面ꎬＧｒ８ＨＧＯ￣１ 仅 具 有 ３ 个 结 合 位 点ꎬ 比 后 ４ 个
密码子 连 续 出 现 的 情 况ꎬ 因 此 可 使 用 大 肠 杆 菌 Ｇｒ８ＨＧＯ 蛋白和 Ｃｒ８ＨＧＯ 蛋白少一个结合位点ꎻ在
ＢＬ２１ 或 Ｒｏｓｅｔｔａ(ＤＥ３)进行诱导表达ꎮ 二聚体界面方面ꎬ所有蛋白都具有 ２９ 个界面接触
利用 ＳＰＯＭＡ 服务器对 ５ 个 Ｇｒ８ＨＧＯ 蛋白与 位点( 表 ５)ꎮ ＧＯ 注释结果表明所有蛋白均参与
Ｃｒ８ＨＧＯ 蛋 白 的 二 级 结 构 进 行 分 析ꎬ 结 果 表 明 氧化还原过程(ＧＯ:００５５１１４)ꎬ分子功能为 Ｚｎ 结
２ ＋
Ｇｒ８ＨＧＯ￣１ 的 α￣螺旋(Ｈ)含量最高ꎬ延伸链(Ｅ)含量 合( ＧＯ: ０００８２７０ ) 和 氧 化 还 原 酶 活 性 ( ＧＯ:
最低ꎬ５ 个 Ｇｒ８ＨＧＯ 蛋白的 β￣转角 ( Ｔ) 含量高于 ００１６４９１)ꎬ未预测到其在细胞组分中的作用ꎮ
Ｃｒ８ＨＧＯꎬＧｒ８ＨＧＯ￣２ 中无规则卷曲含量最低(表 ２)ꎮ ２.３ Ｇｒ８ＨＧＯ￣２ 基因原核表达载体构建
利用 ＳｉｇｎａｌＰ ４.１ 服务器对 ５ 个 Ｇｒ８ＨＧＯ 蛋白 使用 限 制 性 内 切 酶 ＢａｍＨＩ 和 ＸｈｏＩ 对 质 粒
与 Ｃｒ８ＨＧＯ 蛋白的信号肽序列进行分析ꎬ结果均 ｐＥＴ３２ａ￣Ｇｒ８ＨＧＯ￣２ 进行双酶切检测ꎬ结果能 够 切
没有发现信号肽ꎬ表明这些蛋白都是非分泌型蛋 出目的片段和载体(图 ５)ꎬ 表明 Ｇｒ８ＨＧＯ￣２ 基因已
白 ( 表 ２ )ꎮ 使 用 ＴＭＨＭＭ２. ０ 软 件 预 测 ５ 个 成功插入原核表达载体 ｐＥＴ３２ａ 中ꎮ
Ｇｒ８ＨＧＯ 蛋白与 Ｃｒ８ＨＧＯ 蛋白的跨膜螺旋区ꎬ结果 ２.４ Ｇｒ８ＨＧＯ 基因的组织表达分析
表明这些蛋白都不包含跨膜螺旋区域ꎬ为非膜蛋 根据 ５ 个 Ｇｒ８ＨＧＯ 基因序列ꎬ设计一对检测 ５
白( 表 ２ )ꎮ 使 用 ＣｈｌｏｒｏＰ ｖ１. １ Ｓｅｒｖｅｒ 对 ５ 个 个基因表达情况的引物ꎬ 通过 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 技术对
