Page 120 - 《广西植物》2023年第11期

２ ０ ８ ０ 广 西 植 物 ４３ 卷
子休眠、促进种子萌发及其生理生化等方面研究奠 以上萌发阶段各取样约 ３ ｇꎬ用清水冲洗干净ꎬ吸
定基础ꎮ 干表面的水分ꎬ立即放入液氮中冻存 １０ ｍｉｎꎬ再移
入－８０ ℃ 冰箱中保存ꎬ用于 ＲＮＡ 提取ꎮ 上述取样
１ 材料与方法 均 ３ 次生物学重复ꎮ
１.４ 建库测序
１.１ 材料和试剂 取上 述 沙 藏 前 ( Ａ)、 萌 发 后 ( Ｂ)、 微 根 状 茎
试验材料采集于福建省泰宁县ꎬ经福建省农 (Ｃ)、绿色微根状茎( Ｄ)４ 个萌发阶段的种子各约
业科学院农业生物资源研究所陈菁瑛研究员鉴定 ０.５ ｇꎬ采用 ＤＰ４４１￣ＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｕｒｅ 多糖多酚植物总
为多花黄精( Ｐｏｌｙｇｏｎａｔｕｍ ｃｙｒｔｏｎｅｍａ)ꎬ种植于邵武 ＲＮＡ 提取试剂盒[ 天根生化科技( 北京) 有限公
市和平镇和平村林下ꎮ ２０１９ 年 １１ 月采集 １０ 株果 司]分别提取各萌发阶段的总 ＲＮＡꎬ３ 次生物学重
皮发黑的成熟的果实ꎬ经 ８ ｄ 堆置发酵后ꎬ用手捏 复ꎮ ＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ:检测 ＲＮＡ 纯度( ＯＤ ２６０ / ２８０
碎变软的果实ꎬ漂去果皮等杂质并用水清洗ꎬ干净 及 ＯＤ ２６０ / ２３０ 比值) 和 Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ:

的种子作为试验材料备用ꎮ 检测 ＲＮＡ 完整性ꎮ 进一步使用试剂盒 Ｉｌｌｕｍｉｎａ 的
®
ＤＰ４４１￣ＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｕｒｅ 多 糖 多 酚 植 物 总 ＲＮＡ ＮＥＢＮｅｘｔ ＵｌｔｒａＴＭ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔꎬ参照说明
提取试剂盒ꎬ购自天根生化科技( 北京) 有限公司ꎻ 书构 建 文 库ꎮ 构 建 文 库 后ꎬ 先 使 用 Ｑｕｂｉｔ ２. ０
® ＵｌｔｒａＴＭ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔꎬ 购 自
ＮＥＢＮｅｘｔ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ 初 步 定 量ꎬ 再 使 用 Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００
® Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ 检测文库的 ｉｎｓｅｒｔ ｓｉｚｅꎬ符合预期后ꎬ用
Ｉｌｌｕｍｉｎａꎬ Ｉｎｃ.ꎻ ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔ Ａｌｌ￣ｉｎ￣Ｏｎｅ Ｆｉｒｓｔ￣Ｓｔｒａｎｄ
ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ｆｏｒ ｑＰＣＲ( Ｏｎｅ￣Ｓｔｅｐ ｇＤＮＡ ｑＲＴ￣ＰＣＲ 对文库有效浓度进行准确定量ꎮ 库检合
Ｒｅｍｏｖａｌ ) ( ＡＴ３４１ )ꎬ ＰｅｒｆｅｃｔＳｔａｒｔ ® Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ 格后ꎬ由 北 京 诺 禾 致 源 科 技 股 份 有 限 公 司 应 用
ＳｕｐｅｒＭｉｘ (ＤｙｅⅡ)ꎬ购自北京全式金生物技术有限 Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００ 完成序列的测定ꎮ
公司ꎻ无水乙醇ꎬ购自西陇科学股份有限公司ꎮ １.５ 数据分析
１.２ 仪器和设备 １.５.１ 数据组装及注释 将获得的 Ｒａｗ ｒｅａｄｓ 去除
ＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ( 德 国 Ｉｍｐｌｅｎ 公 司 )ꎻ Ａｇｉｌｅｎｔ 带接头、含 Ｎ 和低质量 ｒｅａｄｓꎬ获得 Ｃｌｅａｎ ｄａｔａꎬ并进
２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ( 安捷伦科技有限公司)ꎻ５４２４Ｒ 行 Ｑ２０、Ｑ３０ 和 ＧＣ 含量计算ꎮ 当前多花黄精尚无
高速低温离心机( 德国 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 公司)ꎻ２１００ 凝 参考基因组序列ꎬ因此本研究采用 ｄｅ ｎｏｖｏ 组装方
胶成像仪( 上海勤翔科学仪器有限公司)ꎻ水平电 法ꎬ使用 Ｔｒｉｎｉｔｙ 软件对 Ｃｌｅａｎ ｄａｔａ 进行拼接、组装ꎬ
泳装置(北京市六一仪器厂)ꎻ海尔 ＭＩ￣２２７０Ｍ (Ｎ) 进一步通过 Ｃｏｒｓｅｔ( Ｄａｖｉｄｓｏｎ ＆ Ｏｓｈｌａｃｋꎬ ２０１４) 软
微波炉(青岛海尔微波制品有限公司)ꎻ微量紫外－ 件ꎬ对转录本聚类去冗余ꎬ最终每个 ｃｌｕｓｔｅｒ 被定义
可见光分光光度计( ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ) [ 赛默飞世尔 为“ Ｕｎｉｇｅｎｅ”ꎬ 用 ＢＵＳＣＯ ( Ｂｅｎｃｈｍａｒｋｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ
科技( 中国) 有限公司]ꎻＡＥ１２４ / ＪＹ１０００２ 型电子 Ｓｉｎｇｌｅ￣Ｃｏｐｙ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ) 对拼接得到的 Ｔｒｉｎｉｔｙ. ｆａｓｔａꎬ
分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)ꎻＡＢＩ ｕｎｉｇｅｎｅ. ｆａｓｔａ 和 ｃｌｕｓｔｅｒ. ｆａｓｔａ 进行拼接质量评估ꎬ
ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３ 荧光定量 ＰＣＲ 仪[ 赛默飞世尔科技 作为 后 续 分 析 的 参 考 序 列ꎮ 使 用 ＮＣＢＩ ｂｌａｓｔ 对

(中国)有限公司]ꎮ Ｕｎｉｇｅｎｅ 进行 Ｎｔ 注释ꎬＤｉａｍｏｎｄ 对 Ｕｎｉｇｅｎｅ 进行 Ｎｒ、
１.３ 材料处理 ＫＯＧ / ＣＯＧ、Ｓｗｉｓｓ￣Ｐｒｏｔ 注释ꎬ ＨＭＭＥＲ 对 Ｕｎｉｇｅｎｅ 进
将洗干净的种子用无菌水冲洗 １０ 遍ꎬ立即取 行 Ｐｆａｍ 注释ꎬＫＡＡＳ 对 Ｕｎｉｇｅｎｅ 进行 ＫＥＧＧ 注释ꎬ

约 ３ ｇ 种子ꎬ放入液氮中冻存 １０ ｍｉｎꎬ然后移入－８０ Ｂｌａｓｔ２ ＧＯ 进行 ＧＯ 注释ꎮ
℃ 冰箱中保存ꎬ直到 ＲＮＡ 提取(图 １: Ａ)ꎮ 剩下的 １.５.２ 基因表达水平分析 采用 ＲＳＥＭ 软件( Ｌｉ ＆
种子用于沙藏ꎬ沙藏所需的河沙需经过 １２１ ℃ 灭 Ｄｅｗｅｙꎬ ２０１１)ꎬ调用 Ｂｏｗｔｉｅ２ 对比并对结果进行统
菌 ３０ ｍｉｎꎬ并用少量的无菌水保持河沙湿润ꎬ沙藏 计ꎬ以 Ｔｒｉｎｉｔｙ 拼 接 得 到 的 转 录 组 作 为 参 考 序 列
期间每周定期检查并用无菌水补充水分ꎮ 沙藏 (Ｒｅｆ)ꎬ将每个样品的 ｃｌｅａｎ ｒｅａｄｓ 往 Ｒｅｆ 上做匹配ꎬ
１５０ ｄ 后ꎬ挑选胚刚突破种皮的种子(图 １: Ｂ)和初 获得单个样品的匹配率ꎬ统计每个样品中某基因比
步形成的第一个微根状茎的种子( 图 １: Ｃ)ꎬ种植 对到的 ｒｅａｄｓ 数目ꎬ然后进行 ＦＰＫＭ (ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｎｕｍｂｅｒ
２０ ｄ 后ꎬ挑选变绿的微根状茎的种子( 图 １: Ｄ)ꎬ ｏｆ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｅｒ Ｍｉｌ￣