Page 121 - 《广西植物》2023年第11期

１１ 期 刘保财等: 多花黄精种子萌发前后基因表达特征分析 ２ ０ ８ １

图 １ 种子沙藏前(Ａ)、萌发后(Ｂ)、微根状茎(Ｃ)、绿色微根状茎(Ｄ)
Ｆｉｇ. １ Ｓｅｅｄ ｂｅｆｏｒｅ ｓａｎｄ ｓｔｏｒａｇｅ (Ａ)ꎬ ａｆｔｅｒ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ (Ｂ)ꎬ ｍｉｃｒｏｒｈｉｚｏｍｅｓ (Ｃ)ꎬ ｇｒｅｅｎ ｍｉｃｒｏｒｈｉｚｏｍｅｓ (Ｄ)

ｌｉｏｎｓ ｂａｓｅ ｐａｉｒｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ) 转换ꎬ进而得到单个样 和 Ｕｎｉｇｅｎｅｓ 的最大长度、Ｎ５０ 长度分别为 １５ ８７５、
品中基因和转录本的表达水平ꎮ １５ ８７５、 １ ２９４、 １ ０５９ ｂｐꎮ 获 得 的 １７８ ３１９ 个
１.５.３ 差异基因表达分析 使用基于负二项分布 Ｕｎｉｇｅｎｅｓ 在 Ｎｔ、 Ｎｒ、 ＫＯＧ / ＣＯＧ、 Ｓｗｉｓｓ￣Ｐｒｏｔ、 Ｐｆａｍ、
的模型确定数字基因表达数据中的差异表达的 ＫＥＧＧ、ＧＯ 全部 １００％注释ꎬ各数据注释个数及比
ＤＥＳｅｑ Ｒ 包(１.１０.１)进行两个条件 / 组的差异表达 例 见 表 ３ꎬ ７ 个 数 据 库 共 注 释 了 １７８ ３１９ 个
分析ꎬ使用 Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ 和 Ｈｏｃｈｂｅｒｇ 的方法校正得到 Ｕｎｉｇｅｎｅｓꎮ
Ｐ 值以控制错误发现率ꎬＰａｄｊ<０.０５ 的基因认定为 ２.２ 萌发前后基因表达水平
差异表达ꎮ 基于 ＧＯｓｅｑ( Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１０) 所述 以组装后的序列为模板ꎬ将沙藏前 Ａ１、Ａ２、Ａ３
方法对筛选到的 ＤＥＧｓ 进行 ＧＯ 富集分析ꎮ 基于 和萌发后 Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３ 各样本的 Ｃｌｅａｎ ｒｅａｄｓ 与之比
ＫＥＧＧ 注 释 结 果ꎬ 使 用 ＫＯＢＡＳꎬ 进 行 ＫＥＧＧ 对ꎬ各样本的匹配 ｒｅａｄｓ 数目和匹配率见表 ４ꎬ沙藏
Ｐａｔｈｗａｙ 富集分析(Ｍａｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００５)ꎮ 前的匹配率为 ７５.１９％ ~ ７５.６７％ꎬ萌发后的匹配率
１.５.４ ｑＲＴ￣ＰＣＲ 验证 经过差异表达基因分析后ꎬ 为 ７１. ６３％ ~ ７４. ２３％ꎮ 对各样品表 达 的 Ｕｎｉｇｅｎｅｓ
在植物信号转导通路中ꎬ随机选取 ６ 个差异基因ꎬ 数目进行统计并转换为 ＦＰＫＭꎬ然后根据 ＦＰＫＭ 大
设计引物(表 １)ꎬ以沙藏前后的 ＲＮＡ 为模板ꎬ按照 小划分区间ꎬ各区间的表达量及所占比例见表 ５ꎬ
® 萌发后的 Ｂ１、Ｂ２ 和 Ｂ３ ＦＰＫＭ>１５ 的 Ｕｎｉｇｅｎｅｓ 数量
ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔ Ａｌｌ￣ｉｎ￣Ｏｎｅ Ｆｉｒｓｔ￣Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ＳｕｐｅｒＭｉｘ ｆｏｒ ｑＰＣＲ ( Ｏｎｅ￣Ｓｔｅｐ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖａｌ ) 均高于沙藏前的 Ａ１、Ａ２ 和 Ａ３ꎬ说明经沙藏萌发
(ＡＴ３４１) 试 剂 盒 进 行 反 转 录 合 成 ｃＤＮＡꎮ 参 照 后ꎬ高表达的基因数目得到了增加ꎮ
ＰｅｒｆｅｃｔＳｔａｒｔ ® Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ( ＋ＤｙｅⅡ) 试剂 ２.３ 萌发前后基因表达差异分析
盒说明书ꎬ以 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ在 ＡＢＩ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３ 比较萌发前后的各样品基因( 图 ２: Ａ)ꎬ共有
－ΔΔＣｔ 方法计算每个基因 显著性差异的 Ｕｎｉｇｅｎｅｓ １１ ８１７ 个ꎬ其中表达上调
仪上完成 ｑＲＴ￣ＰＣＲꎮ 用 ２
在不同样品中的相对表达量( Ｌｉｖａｋ ＆ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎꎬ 的有 ６ ４０５ 个ꎬ表达下调的有 ５ ４１２ 个ꎮ 进一步将
２００１)ꎮ Ａｃｔｉｎ 为内参基因ꎮ 上调或下调差异基因在 ＧＯ 数据库中富集( 图 ２:
Ｂ)ꎬ无论是上调还是下调的差异基因ꎬ均主要富集
２ 结果与分析 在生 物 过 程 ( ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓꎬ ＢＰ ) 和 分 子 功 能
(ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎꎬＭＦ) 中ꎬ相 对 而 言ꎬ细 胞 组 成
２.１ 转录组测序和 ｄｅ ｎｏｖｏ 组装 (ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔꎬＣＣ)富集的转录本较少ꎮ 而在
测序后ꎬ获得的具体数据见表 ２ꎬ各样本获得 ＢＰ 中差异表达基因主要参与代谢过程、单生物代

了 ４２ ５８９ ４７０ 以上的 Ｒａｗ ｒｅａｄｓꎬ过滤后得到 ６.０３ 谢过程等ꎬ如参与代谢过程的显著差异表达基因
Ｇｂ 以 上 的 测 序 量ꎬ Ｑ３０ ≥ ９３. ０４％ꎬ ＧＣ 含 量 为 中上调 的 有 ２ ２５１ 个ꎬ 下 调 的 有 １ ５１６ 个ꎬ 包 括
４６.９８％ ~ ４９.４７％ꎮ 由于尚无多花黄精的全基因组 Ｃｌｕｓｔｅｒ￣４０８４５.０、Ｃｌｕｓｔｅｒ￣１１０９９.０ 等上调的基因和

作为参考ꎬ因此采用 ｄｅ ｎｏｖｏ 方法对序列进行组装ꎬ Ｃｌｕｓｔｅｒ￣６８６１５.７９３７２、 Ｃｌｕｓｔｅｒ￣６８６１５. ８７３４９ 等 下 调
分别获得了 ３８８ ２３１ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ (３６１ ９５６ １５７ ｂｐ) 的基因ꎮ 在 ＭＦ 中差异表达基因主要参与催化活
和１７８ ３１９ Ｕｎｉｇｅｎｅｓ (１４６ ０２２ ９１３ ｂｐ)ꎬＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ 性、氧化还原酶活性等ꎬ 如参与催化活性的显著差