Page 109 - 《广西植物》2023年第7期

７ 期 周黎等: 除虫菊 ＴｃＡＬＤＨ 和 ＴｃＧＬＩＰ 基因启动子克隆及功能分析 １ ２ ７ ７

Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｎａｔｕｒａｌ ｐｙｒｅｔｈｒｉｎ ｉｓ ａ ｇｒｅｅｎ ｂｏｔａｎｉｃａｌ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ ｔｈａｔ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｂｏｖｅｇｒｏｕｎｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｐｙｒｅｔｈｒｕｍ
(Ｔａｎａｃｅｔｕｍ ｃｉｎｅｒａｒｉｉｆｏｌｉｕｍ). Ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ (ＴｃＡＬＤＨ) ａｎｄ ＧＤＳＬ ｌｉｐａｓｅ (ＴｃＧＬＩＰ) ａｒｅ ｋｅｙ ｒａｔｅ￣ｌｉｍｉｔｉｎｇ
ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐｙｒｅｔｈｒｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｐｙｒｅｔｈｒｕｍ. Ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｏｆ ＴｃＡＬＤＨ ａｎｄ ＴｃＧＬＩＰ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ
ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ ｐｙｒｅｔｈｒｕｍ ｃｌｏｎｅ ‘Ｗ９９’ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅｓｅ
ｇｅｎｅｓ. Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓꎬ ａｃｔｉｖｉｔｙꎬ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ
ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓꎬ ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ (ＧＵＳ ｓｔａｉｎｉｎｇ)ꎬ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｉｎｇꎬ ａｎｄ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｈｏｒｍｏｎｅ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ: (１) Ｕｓｉｎｇ ｐｙｒｅｔｈｒｕｍ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｓ ａ ｔｅｍｐｌａｔｅꎬ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ
ｃｌｏｎｅ ｔｈｅ ｐＴｃＡＬＤＨ ａｎｄ ｐＴｃＧＬＩＰ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ. Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｅｎｇｔｈｓ ｏｆ ｐＴｃＡＬＤＨ ａｎｄ ｐＴｃＧＬＩＰ ｗｅｒｅ ２ ８４８ ａｎｄ １ ３４３ ｂｐꎬ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｔｈｅ ＰｌａｎｔＣＡＲＥ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｙ ｂｏｔｈ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｉｓ￣ｅｌｅｍｅｎｔｓ
ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｉｇｎａｌｓ. (２) Ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｕｓｅｄ ｂｙ ｐＴｃＡＬＤＨ ａｎｄ ｐＴｃＧＬＩＰ ａｎｄ
ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄꎬ ａｎｄ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ｔｏｂａｃｃｏ (Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ) ｔｏ ａｎａｌｙｓｅ ｈｏｒｍｏｎｅ
ｉｎｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ｏｂｓｅｒｖｉｎｇ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｅａｖｅｓ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐＴｃＡＬＤＨ
ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｔｙｐｉｃａｌ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌ ｊａｓｍｏｎａｔｅ (ＭｅＪＡ) ａｎｄ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ (ＡＢＡ)ꎬ ｗｈｅｒｅａｓ ｔｈｅ ｐＴｃＧＬＩＰ
ｓｈｏｗｅｄ ｎｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅ. (３) Ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｏｆ ｐｙｒｅｔｈｒｕｍ ‘Ｗ９９’ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＭｅＪＡ ａｎｄ ＡＢＡꎬ ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴｃＡＬＤＨ ｗａｓ ｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＡＢＡ ｗｉｔｈｉｎ １２ ｈꎬ ａｎｄ ｆｉｒｓｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｕｎｄｅｒ ＭｅＪＡ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔꎻ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴｃＧＬＩＰ ｗａｓ ｄｏｗｎ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＡＢＡ ａｎｄ ＭｅＪＡ. (４) Ｗｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ
ｏｆ ｐＴｃＡＬＤＨ ａｎｄ ｐＴｃＧＬＩＰ ｆｕｓｅｄ ｗｉｔｈ ＧＵＳ ｒｅｐｏｒｔｅｒｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｔｈｅｍ ｉｎｔｏ ｔｏｂａｃｃｏꎬ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｄｒｉｖｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧＵＳ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｓｈｏｗｅｄ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ. Ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐＴｃＡＬＤＨ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ
ｔｈｅ ｇｌａｎｄｓꎬ ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｈａｉｒ ｈｅａｄｓ ａｎｄ ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓꎬ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｐＴｃＧＬＩＰ ｗａｓ ｏｎｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ
ｃｅｌｌ. Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐＴｃＡＬＤＨ ａｎｄ ｐＴｃＧＬＩＰ ｗｅｒｅ ｔｉｓｓｕｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｐＴｃＡＬＤＨ ａｐｐｅａｒｅｄ
ＭｅＪＡ￣ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ａｎｄ ＡＢＡ￣ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ. Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ
ＴｃＡＬＤＨ ａｎｄ ＴｃＧＬＩＰ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐｙｒｅｔｈｒｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｔａｎａｃｅｔｕｍ ｃｉｎｅｒａｒｉｉｆｏｌｉｕｍꎬ ＴｃＡＬＤＨꎬ ＴｃＧＬＩＰꎬ ｐｒｏｍｏｔｅｒꎬ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ

除虫菊(Ｔａｎａｃｅｔｕｍ ｃｉｎｅｒａｒｉｉｆｏｌｉｕｍ) 作为一种多 和 瓜 叶 酮 醇 ) 酯 化 形 成 ( Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ ＆ Ｒｕｚｉｃｋａ
年生菊科植物ꎬ几个世纪以来一直被用于提取绿色 １９２４ꎻ Ｍｏｓｓａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)ꎮ 酸前体来源于萜烯途
植物源杀虫剂除虫菊酯(Ｌｙｂｒａｎｄ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０)ꎮ 其 径的质 体 甲 基 赤 藓 醇￣４ 磷 酸 ( ｍｅｔｈｙｌｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ ４￣
因提取于花头的除虫菊酯具有杀虫迅速、无富集易 ｐｈｏｓｐｈａｔｅꎬ ＭＥＰ)途径(Ｌｙｂｒａｎｄ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０)ꎬ酮醇
降解、对哺乳动物毒性小、适用于敏感人群等特性ꎬ 前体来源于茉莉酸类激素( ｊａｓｍｏｎａｔｅｓꎬ ＪＡａｓ) 途径
被广 泛 应 用 于 有 机 农 业 和 家 居 防 治 ( Ｎｅｌｓｏｎꎬ (Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００５)ꎮ 在除虫菊酯单萜合成模
１９７４)ꎬ其花头还能够释放大量挥发性萜烯 ( Ｅ)￣ 型中ꎬ两分子二甲基烯 丙 基 二 磷 酸 ( ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙｌ
ｂｅｔａ￣法尼烯 [(Ｅ)￣ｂｅｔａ￣ｆａｒｎｅｓｅｎｅꎬ Ｅ bＦ]ꎬ 能够在田 ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅꎬ ＤＭＡＰＰ)首先在腺体中依次由菊基
间吸引瓢虫驱避蚜虫 ( Ｌｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９ꎻ Ｌｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ 二磷酸合成酶( ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅꎬ
２０２１)ꎬ同时吸引大量授粉昆虫如食蚜蝇等(Ｚｅｎｇ ｅｔ ＣＤＳ)、 乙 醇 脱 氢 酶 ２ ( ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２ꎬ
ａｌ.ꎬ ２０２１ꎻ 曾拓等ꎬ２０２１)ꎮ 因此ꎬ除虫菊也作为一 ＡＤＨ２)、 醛 脱 氢 酶 １ ( ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １ꎬ
种间作作物ꎬ在我国云南有广泛的应用( 周黎等ꎬ ＡＬＤＨ１)催化形成前体分子菊酸ꎬ随后菊酸被运输
２０２２)ꎮ 全世界对除虫菊酯的需求较大ꎬ将其作为 到腺体下方的皮下组织ꎬ最终在种子和果皮中被
天然植物源杀虫剂以避免过度使用化学合成杀虫 ＧＤＳＬ 脂肪酶( ＧＤＳＬ ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎꎬ ＧＬＩＰ) 催化形
剂(Ｓｕｒａｗｅｅｒａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７)ꎮ 因此ꎬ如何提高除虫菊 成除虫 菊 酯ꎬ 后 被 胚 胎 吸 收 转 移 至 幼 苗 组 织 中
酯的含量一直是除虫菊产业和基础研究的热点和 (Ｋｉｋｕｔａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１２ꎻ Ｒａｍｉｒｅｚ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１２ꎻ Ｘｕ ｅｔ
重点ꎮ ａｌ.ꎬ ２０１８ꎻ Ｌｙｂｒａｎｄ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０ꎻ Ｌｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２２ａ)ꎮ
除虫菊酯在植物体内由单萜羧基部分( 菊酸 ＴｃＡＬＤＨ 参与除虫菊酸部分最后一步催化反应合
和除虫菊酸) 和酮醇部分( 除虫菊酮醇、茉莉酮醇 成菊酸 ＣｏＡꎬ菊酸 ＣｏＡ 和酮醇则在 ＴｃＧＬＩＰ 的催化