Page 110 - 《广西植物》2023年第7期
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１ ２ ７ ８ 广 西 植 物 ４３ 卷
作用 下 通 过 酯 键 相 连 合 成 最 终 产 物 除 虫 菊 酯 落进行测序ꎮ 利用除虫菊基因组对获得的片段进
(Ｋｉｋｕｔａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１２ꎻ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２２)ꎮ 由此可 行检验ꎮ 利用 ＰｌａｎｔＣＡＲＥ 软件对启动子的元件进
知ꎬ ＴｃＡＬＤＨ 和 ＴｃＧＬＩＰ 是除虫菊酯合成的关键限 行预测ꎮ
速酶基因ꎮ 目前ꎬ已经从拟南芥和棉花中克隆到 １.３ 载体构建
大量 ＡＬＤＨ 和 ＧＬＩＰ 基因的启动子( Ｈｏｕ ＆ Ｂａｒｔｅｌｓꎬ 以测序正确的质粒为模板ꎬ分别利用含有同
２０１５ꎻ Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７ꎻ Ｍａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８ꎻ Ｙａｎｇ ｅｔ 源重 组 片 段 的 引 物 Ｌｕｃ￣ａｌｄｈ￣Ｆ、 Ｌｕｃ￣ａｌｄｈ￣Ｒ、 Ｌｕｃ￣
ａｌ.ꎬ ２０２１)ꎬ此外ꎬ高粱、大豆以及黄花蒿等物种中 ｇｌｉｐ￣Ｆ、Ｌｕｃ￣ｇｌｉｐ￣Ｒ( 表 １) 进行扩增ꎮ 回收 ＰＣＲ 产
也报道了 ＡＬＤＨ 基因的启动子ꎮ 然而从除虫菊中 物ꎬ连接到经 ＨｉｎｄⅢ酶切的 ｐＧｒｅｅｎＩＩ ０８００￣ＬＵＣ 载
仅分离出一个具有腺体特异表达的菊基二磷酸合 体上ꎬ转化大肠杆菌ꎬ挑选单菌落进行测序ꎬ选取
成酶基因 ＴｃＣＨＳ 的启动子( Ｓｕｌｔａｎａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５)ꎮ 测序正确的载体转化 ＧＶ３１０１ 农杆菌ꎮ
因此ꎬ研究其他除虫菊酯合成酶基因的启动子是 以测序正确的质粒为模板ꎬ分别利用含有同
解析除虫菊酯合成调控机制的前提ꎮ 源重组片段的引物 Ｆ￣ａｌｄｈ１２１ｐｒｏ、Ｒ￣ａｌｄｈ１２１ｐｒｏ、Ｆ￣
茉莉酸及其衍生物不仅作为反应底物参与除 ｇｌｉｐ１２１ｐｒｏ、Ｒ￣ｇｌｉｐ１２１ｐｒｏ ( 表 １) 进 行 扩 增ꎮ 回 收
虫菊酯酮醇部分的生物合成ꎬ同时作为防御应激类 ＰＣＲ 产物ꎬ 连 接 到 经 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 和 ＢａｍＨ Ｉ 酶 切 的
激素调控除虫菊酯的合成(Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００５ꎻ Ｌｉ ＰＢＩ１２１ 载体上ꎬ转化大肠杆菌ꎬ挑选单菌落进行测
ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)ꎮ 课题组前期进行了茉莉酸甲酯处理 序ꎬ选取测序正确的载体转化 ＥＨＡ１０５ 农杆菌ꎮ
下的白花除虫菊叶片和花期转录组数据分析ꎬ注释 １.４ 烟草中 ＬＵＣ 瞬时表达和荧光成像
到了很多与除虫菊酯合成代谢相关的基因ꎮ 基于 将含有重组 ｐＧｒｅｅｎⅡ ０８００￣ＬＵＣ 载体的农杆菌
此ꎬ本 研 究 通 过 除 虫 菊 无 性 系 ‘ Ｗ９９’ 克 隆 得 到 单菌落接种到发根农杆菌培养基(ＹＥＢ)中ꎬ培养至
ＴｃＡＬＤＨ 和 ＴｃＧＬＩＰ 基因的启动子序列ꎬ对其调控元 ＯＤ６００ ＝ ０.５ꎬ５ ０００ ｒｍｉｎ 离心 ７ ｍｉｎ 后ꎬ用 ＭＥＳ 侵
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件、启动子活性、激素诱导特异性和组织特异性进 染液重悬ꎬ调节至 ＯＤ６００ ＝ １.０ꎮ 选取生长 ２ 至 ３ 周
行了分析ꎬ进一步揭示除虫菊酯的合成机制及代谢 的本氏烟草ꎬ用无针头的注射器将农杆菌菌液注射
调控中植物激素的作用ꎬ从而为培育除虫菊优良品 到烟草叶片ꎬ叶片左半部分注射含有空载 ｐＧｒｅｅｎⅡ
种和提高除虫菊酯含量提供理论依据ꎮ ０８００￣ＬＵＣ 载体的农杆菌ꎬ右半部分注射含有重组
ｐＧｒｅｅｎⅡ ０８００￣ＬＵＣ 载体的农杆菌ꎮ 注射后的烟草
１ 材料与方法 置于人工气候室中培养 ２ ｄ 后ꎬ在烟草叶片上喷施
５０ μｍｏｌＬ 的脱落酸(ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄꎬ ＡＢＡ)ꎬ浓度参
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１.１ 实验材料 考胡慧敏等(２０２１)的方法ꎬ或喷施 １００ μｍｏｌＬ 的
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除虫菊无性系‘Ｗ９９’ 的叶片取自华中农业大 茉莉酸甲酯(ｍｅｔｈｙｌ ｊａｓｍｏｎａｔｅꎬ ＭｅＪＡ)ꎬ浓度参考陈
学组培室ꎮ 大肠杆菌 ＤＨ５α 和根癌农杆菌 ＧＶ３１０１、 雨倩等(２０２１)的方法ꎬ以喷施清水植株的叶片作为
ＥＨＡ１０５ 购自上海唯地生物技术有限公司ꎮ 用于转 对照ꎮ 放 置 １２ ｈ 后ꎬ 将 Ｄｕａｌ￣Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ
化的本氏烟草(Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ) 在 ２５ ℃、１６ Ａｓｓａｙ 试 剂 盒 中 的 Ｌｕａｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ 与
ｈ 光照/ ８ ｈ 黑暗条件的组培室中生长ꎮ Ｌｕａｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ 混合ꎬ涂抹在烟草的注射
１.２ 启动子克隆 区ꎬ然后使用 ＬＢ ９８５ Ｎｉｇｈｔｓｈａｄｅ ｓｙｓｔｅｍ ( Ｂｅｒｔｈｏｌｄꎬ
利用 ＲａＰｕｒｅ ｐｌａｎｔ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ(美基生物ꎬ 中 Ｂａｄ Ｗｉｌｄｂａｄꎬ德国)仪器观察荧光ꎮ
国)提取除虫菊叶片的 ｇＤＮＡ 作为模板ꎬ依据除虫 １.５ 不同激素处理下除虫菊 ＴｃＡＬＤＨ 和 ＴｃＧＬＩＰ
菊基因组( Ｙａｍａｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９)ꎬ设计 ＴｃＡＬＤＨ 基因表达分析
基因启动子的特异引物 Ｆ￣ＡＬＤＨ￣ｐｒｏ 及 ＯＲＦ 下游 ＭｅＪＡ 处 理: 以 继 代 培 养 一 个 月 的 除 虫 菊
Ｒ￣ＡＬＤＨ￣ＯＲＦ(表 １)ꎬＴｃＧＬＩＰ 基因启动子的特异引 ‘Ｗ９９’ 无 性 系 作 为 实 验 材 料ꎬ 使 用 ５ ｍＬ 的 ２
物 Ｆ￣ＧＬＩＰ￣ｐｒｏ 及 ＯＲＦ 下游 Ｒ￣ＧＬＩＰ￣ＯＲＦ(表 １)ꎬ利 ｍｍｏｌＬ 的 ＭｅＪＡ 溶液喷施处理组培苗ꎬ浓度参
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用 高 保 真 酶 Ｈｉｇｈ￣Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ( ＭＣＬＡＢꎬ 考(Ｂｕｒａｐｈａｋａ ＆ Ｐｕｔａｌｕｎꎬ ２０２０)ꎬ拧紧瓶盖ꎬ培养
Ｃｈｉｎａ)进行扩增ꎬ将扩增产物连接到 ｐＢＬＵＥ￣Ｔ 载 ０、４、１２ ｈ 后ꎬ将实验材料叶片放置在液氮中迅速
体(ＺＯＭＡＮＢＩＯꎬ Ｃｈｉｎａ)ꎬ转化大肠杆菌ꎬ挑选单菌 冷却后ꎬ保存于－８０ ℃ 冰箱ꎮ
