Page 111 - 《广西植物》2023年第7期
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７ 期 周黎等: 除虫菊 ＴｃＡＬＤＨ 和 ＴｃＧＬＩＰ 基因启动子克隆及功能分析 １ ２ ７ ９
ＡＢＡ 处 理: 以 继 代 培 养 一 个 月 的 除 虫 菊 表 １ 实验所用引物
‘Ｗ９９’ 无 性 系 作 为 实 验 材 料ꎬ 使 用 ５ ｍＬ 的 １ Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
ｍｍｏｌＬ 的 ＡＢＡ 溶液喷施处理组培苗ꎬ拧紧瓶 序列 ５′到 ３′(从左到右)
￣１
引物
盖ꎬ培养 ０、４、１２ ｈ 后ꎬ将实验材料叶片放置在液氮 Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ５′ ｔｏ ３′
(ｆｒｏｍ ｌｅｆｔ ｔｏ ｒｉｇｈｔ)
中迅速冷却后ꎬ保存于－８０ ℃ 冰箱ꎮ
Ｌｕｃ￣ａｌｄｈ￣Ｆ ＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＡＡＡＣＴＡＧ
利用 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ 分析两种激素处理后的基 ＡＡＧＣＡＡＡＧＡＴＣＡＴＣＧＴＡＣＴＴＣ
因表达水平ꎮ ＲＮＡ 提取使用植物 ＲＮＡ 提取试剂盒 Ｌｕｃ￣ａｌｄｈ￣Ｒ ＣＡＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＡＡＧＣＴＴＡＧＣＴＴＡＴ
ＡＴＧＴＧＣＴＣＡＧＡＣＡＡＧＡＧＧＴ
Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｋｉｔ(ＣＷＢＩＯ 康为世纪生物科技有限 Ｌｕｃ￣ｇｌｉｐ￣Ｆ ＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＣＣＣＣＴＣＴ
ＡＴＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＴＴＴＡＡＴＴＣＴＴＧ
公司)ꎬ反转录形成 ｃＤＮＡꎬ使用 ＥａｓｙＳｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ￣Ｓｔｅｐ
Ｌｕｃ￣ｇｌｉｐ￣Ｒ ＣＡＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣ
ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖａｌ ａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ(ＴＲＡＮ ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴ
北京全式金生物技术有限公司) 进行荧光定量分 Ｆ￣ＧＬＩＰ￣ｐｒｏ ＡＡＡＣＴＡＧＡＡＧＣＡＡＡＧＡＴＣＡＴＣＧＴＡＣＴ
Ｒ￣ＧＬＩＰ￣ＯＲＦ ＴＴＡＡＣＡＴＧＧＧＴＧＴＴＧＡＴＧＴＧＧＴ
析ꎬ荧 光 定 量 的 仪 器 为 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００
ｐｌａｔｆｏｒｍꎬ试剂为 ２×Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ(Ａｉｄｌａｂꎬ北 Ｆ￣ＡＬＤＨ￣ｐｒｏ ＣＣＣＣＴＣＴＡＴＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＴＴＴＡＡＴＴＣ
Ｒ￣ＡＬＤＨ－ＯＲＦ ＧＡＡＣＴＴＧＡＴＧＴＣＡＴＡＡＧＣＴＡＡ
京艾德莱生物科技有限公司)ꎬ荧光定量使用的引
Ｆ￣ｇｌｉｐ１２１ｐｒｏ ＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＡＡＡＣ
物为 ＴｃＡＬＤＨ￣ＲＴ￣Ｆ、 ＴｃＡＬＤＨ￣ＲＴ￣Ｒ、 ＴｃＧＬＩＰ￣ＲＴ￣Ｆ、 ＴＡＧＡＡＧＣＡＡＡＧＡＴＣＡＴＣＧＴ
Ｒ￣ｇｌｉｐ１２１ｐｒｏ ＧＧＡＣＴＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＴＡ
ＴｃＧＬＩＰ￣ＲＴ￣Ｒ、ＴｃＧＡＰＤＨ￣Ｆ 和 ＴｃＧＡＰＤＨ￣Ｒ ( 表 １)
ＴＡＴＧＴＧＣＴＣＡＧＡＣＡＡＧＡＧＧＴ
(Ｒａｍｉｒｅｚ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１２)ꎮ Ｆ￣ａｌｄｈ１２１ｐｒｏ ＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＣＴＣＴ
１.６ 烟草遗传转化筛选及 ＧＵＳ 表达 ＡＴＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＴＴＴＡＡＴＴＣＴＴＧ
Ｒ￣ａｌｄｈ１２１ｐｒｏ ＧＧＡＣＴＧＡＣＣＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＣＴＣ
将含有 ｐＴｃＧＬＩＰ￣ＧＵＳ 质粒的农杆菌单菌落接种 ＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴ
到 ＹＥＢ 液体培养基中ꎬ培养至 ＯＤ６００ ＝ ０.５ꎬ５ ０００ Ｒ￣ＧＵＳ￣Ｔ ＴＧＧＣＣＴＧＣＣＣＡＡＣＣＴＴＴＣＧ
￣１ Ｒ￣ａｌｄｈ￣ｐｒｏ２８０ ＧＧＣＧＡＣＧＧＴＡＧＧＡＡＣＴＣＡＡ
ｒ ｍｉｎ 离 心 ７ ｍｉｎ 后ꎬ 用 液 体 ＭＳ ( Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆
Ｆ￣ｎｐｔ ｉｉ￣ｏｒｆ ＡＴＧＡＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣ
Ｓｋｏｏｇ)基本培养基重悬ꎬ调节至 ＯＤ６００ ＝ ０.５ꎮ 将烟
Ｒ￣ｎｐｔ ｉｉ￣ｏｒｆ ＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧ
草叶片切成 ０.５ ｃｍ×０.５ ｃｍꎬ放入农杆菌菌液ꎬ侵染
Ｆ￣Ｒｅｖｅｒｓｅ￣ｎｐｔ ｉｉ ＴＣＣＴＧＴＣＡＡＡＣＡＣＴＧＡＴＡＧ
１０ ｍｉｎ 后ꎬ在滤纸上晾干ꎬ将侵染后的烟草叶片转 Ｒ￣Ｒｅｖｅｒｓｅ￣ｎｐｔ ｉｉ ＡＧＧＡＴＡＴＡＴＴＧＧＣＧＧＧＴＡＡＡＣＣ
移至共培养培养基上ꎬ培养基配方为 ＭＳ 基本培养 ＴｃＡＬＤＨ￣ＲＴ￣Ｆ ＣＡＴＴＣＣＧＣＴＡＣＴＴＴＧＣＴＧＧＴＧＣ
￣１ ＴｃＡＬＤＨ￣ＲＴ￣Ｒ ＴＣＣＡＡＧＧＡＡＴＧＡＴＧＴＧＴＣＣＡＡＣＴＡＣ
基＋２.２５ ｍｇＬ ６￣苄氨基嘌呤(６￣ｂｅｎｚｙｌａｄｅｎｉｎｅꎬ ６￣
ＴｃＧＬＩＰ￣ＲＴ￣Ｆ ＧＣＣＧＧＧＡＡＴＧＣＧＡＧＣＡＡＡＡＣＡＡＣ
￣１
ＢＡ) ＋ ０.３ ｍｇＬ １￣萘乙酸(１￣ｎａｐｈｔｈｙｌａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄꎬ
ＴｃＧＬＩＰ￣ＲＴ￣Ｒ ＣＧＣＴＣＴＣＧＣＣＴＴＣＣＴＴＡＡＡＡＣＣＡＴＡ
ＮＡＡ)ꎬ黑暗条件下培养 ２ ｄ 后ꎬ将叶片转移至筛选
ＴｃＧＡＰＤＨ￣Ｆ ＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＧＧＡＡＡＧＣＴＧ
培养基ꎬ培养基配方为 ＭＳ 基本培养基＋２.２５ ｍｇ ＴｃＧＡＰＤＨ￣Ｒ ＧＴＴＧＴＴＧＴＴＣＡＡＡＧＣＧＡＴＴＣＣＡＧＣ
Ｌ ６￣ＢＡ＋０.３ ｍｇＬ ＮＡＡ＋４００ ｍｇＬ 头孢霉素
￣１
￣１
￣１
￣１
(ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅꎬ Ｃｅｆ)＋５０ ｍｇＬ 卡那霉素(ｋａｎａｍｙｃｉｎꎬ
将继代培养一个月的阳性烟草用 ＧＵＳ Ｓｔａｉｎｉｎｇ
Ｋａｎ)ꎬ每 ２ 周继代一次ꎬ当抗性芽生长至 １ ｃｍ 时ꎬ
Ｋｉｔ(Ｃｏｏｌａｂｅｒꎬ 中国) 进行染色ꎬ实验步骤参照试剂
￣１
将抗性芽切下ꎬ放置在含有 ４００ ｍｇＬ Ｃｅｆ 和 ５０
盒说明书ꎬ染色后用 ７０％的酒精脱色至叶片完全褪
￣１
ｍｇＬ Ｋａｎ 的 ＭＳ 培养基中ꎬ继续培养ꎮ
提取卡纳霉素抗性本氏烟草叶片的 ＤＮＡꎬ以 绿后ꎬ在体视显微镜下观察染色情况ꎮ 每个启动子
其为模板ꎬ用 Ｆ￣ａｌｄｈ１２１ｐｒｏ 作为上游ꎬＴｃＡＬＤＨ 启动 均取 ３ 个独立的转基因株系进行染色ꎮ
子 特 异 引 物 Ｒ￣ａｌｄｈ￣ｐｒｏ２８０ 作 为 下 游ꎬ 检 验
ｐＴｃＡＬＤＨ￣ＧＵＳ 转基因烟草ꎻ用 Ｆ￣ｇｌｉｐ１２１ｐｒｏ 作为上 ２ 结果与分析
游ꎬＲ￣ＧＵＳ￣Ｔ 作为下游ꎬ检验 ｐＴｃＧＬＩＰ￣ＧＵＳ 转基因
烟草ꎬ转化所用菌株为阳性对照ꎬ野生烟草为阴性 ２.１ ＴｃＡＬＤＨ 和 ＴｃＧＬＩＰ 启动子克隆
以提取的除虫菊基因组 ＤＮＡ 为模板ꎬ使用特
对照ꎮ 植物 ＤＮＡ 提取试剂盒为 ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ
异性引物 Ｆ￣ＡＬＤＨ￣ｐｒｏ 和 Ｒ￣ＡＬＤＨ￣ＯＲＦ 克隆得到
Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ(美基生物ꎬ中国)ꎬＰＣＲ 扩增 ｍｉｘ 为 ２×Ｔａｑ
ＴｃＡＬＤＨ 基因 ＡＴＧ 上游 ２ ８４８ ｂｐ 的启动子序列ꎬ使
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ(近岸蛋白质科技有限公司ꎬ中国)ꎮ
